Alle Influenzaviren sollten gemäß den entsprechenden Anforderungen an die biologische Sicherheitsstufe (BSL-2 oder höher) behandelt werden, wie sie in der Biosicherheit in mikrobiologischen und biomedizinischen Laboratorien (BMBL) definiert sind.
>1. Vorbereitung von Reagenzien und Ausgangsmaterial
- Bereiten Sie Madine Darby Canine Kidney-α2,6-sial-Transferase (MDCK-SIAT1)-Zellen und steriles Zellkulturmedium vor
- Bereiten Sie das MDCK-SIAT1-Zellkulturmedium mit 500 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) mit hohem Glukosegehalt, 10 % v/v hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS), 2 mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, 1 mg/ml G418-Sulfat (z. B. Geneticin) und 100 U/ml Penicillin mit 100 μg/ml Streptomycin (optional) vor. Sterilisieren Sie durch Filtration durch eine Membran mit einer Porengröße von 0,2 μM. G418-Sulfat wird zugesetzt, um die Plasmidstabilität in den MDCK-SIAT1-Zellen zu gewährleisten.
- Bereiten Sie die MDCK-SIAT1-Zelllinie vor. In einem 162cm großen 2-Gewebe-Kulturkolben mit 30 ml sterilem Zellkulturmedium werden Samenkolben mit 2 - 2,5 x 106 MDCK-SIAT1-Zellen aufgefüllt und 2 Tage lang bei 37 °C in 5 % CO2 inkubiert; dies wird für die Bestimmung der infektiösen Dosis in Gewebekulturen (TCID) und MN-Assays verwendet.
Anmerkung: MDCK-SIAT1-Zellen wurden freundlicherweise von Dr. M. Matrosovich, Marburg, Deutschland, zur Verfügung gestellt. Diese Zelllinie kann auch kommerziell bezogen werden (siehe Materialtabelle).
- Bereiten Sie das sterile Virusvermehrungsmedium mit 500 ml DMEM-hoher Glukose, 0,3 % Rinderserumalbumin (BSA)-Fraktion V, 100 μg/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin und 20 mM N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure (HEPES) vor. Sterilisieren Sie durch Filtration durch eine Membran mit einer Porengröße von 0,2 μM.
- Bereiten Sie 0,75 % (v/v) rote Blutkörperchen (gpRBCs) von Meerschweinchen in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit 0,01 M PBS bei einem pH-Wert von 7,2 auf.
- Bereiten Sie das sterile Virusverdünnungsmittel mit DMEM mit hohem Glukosegehalt, 1 % Rinderalbuminfraktion V (BSA), 100 μg/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin und 20 mM HEPES vor. Sterilisieren Sie durch Filtration mit einer Membran mit einer Porengröße von 0,2 μm und bereiten Sie sie frisch für jeden Assay vor.
- Bereiten Sie das Kaltzellen-Fixiermittel als 80% kaltes Aceton in PBS (0,01 M PBS, pH 7,2) vor.
- Bereiten Sie den Waschpuffer mit PBS (0,01 M PBS pH 7,2) und 0,3 % (v/v) Tween-20 vor.
- Bereiten Sie das Antikörperverdünnungsmittel mit PBS (0,01 M PBS, pH 7,2), 0,3 % (v/v) Tween-20 und 5 % fettfreier Trockenmilch vor.
- Verwenden Sie als primären Antikörper den monoklonalen Anti-Influenza-Antikörper-A-NP-Maus-Klon-Pool A1 und A3. Verdünnen Sie es mit dem Antikörperverdünnungsmittel in der optimalen Konzentration, die durch Titration bestimmt wird.
- Als sekundären Antikörper wird Anti-Maus-IgG verwendet, das an Meerrettichperoxidase (HRP) konjugiert ist. Verdünnen Sie es mit dem Antikörperverdünnungsmittel in der optimalen Konzentration, die durch Titration bestimmt wird.
- Bereiten Sie das Peroxidasesubstrat mit o-Phenylendiamindihydrochlorid (OPD) in 0,05 M Phosphatcitratpuffer bei pH 5 vor. Bereiten Sie 0,05 M Phosphatcitratpuffer vor, indem Sie 1 Kapsel/100 ml deionisiertes H2O auflösen. Lösen Sie 1 OPD-Tablette (10 mg)/20 ml Phosphatcitratpuffer unmittelbar vor Gebrauch auf.
- Verwenden Sie 0,5 M Schwefelsäure als OPD-Stopplösung. 28 mL 18 M Schwefelsäurestock zu 972 mL deionisiertem H2O in einer chemischen Haube hinzufügen.
- Behandlung von humanen und tierischen Seren
- Die in den MN-Assays verwendeten humanen Seren werden 30 Minuten vor dem Assay in einem Wasserbad bei 56 °C hitzeinaktiviert. Sofort verwenden oder bei Bedarf aufgetaute Seren nicht länger als 24 Stunden bei 4 °C lagern; Wenn eine längere Lagerzeit erforderlich ist, lagern Sie Seren gefroren bei -20 °C oder kälter.
- Behandeln Sie die in den MN-Assays verwendeten tierischen Seren mit Rezeptorzerstörendem Enzym (RDE) und inaktivieren Sie sie vor dem Assay wie folgt.
- Tauen Sie die Seren in einem 37 °C warmen Wasserbad auf und legen Sie sie auf Eis. Mischen Sie 1 Volumen der tierischen Serumprobe mit 3 Volumen RDE. Bei 37 °C 18 - 20 h inkubieren.
- Die mit RDE behandelten Seren werden 30 Minuten lang bei 56 °C hitzeinaktiviert. Geben Sie 6 Volumina PBS, pH 7,2 zu jeder Probe für eine abschließende Vorverdünnung von 1:10. Bei Bedarf sind aufgetaute Seren nicht länger als 24 Stunden bei 4 °C zu lagern. Wenn eine längere Lagerzeit erforderlich ist, lagern Sie Seren gefroren bei -20 °C oder kälter.
Anmerkung: Tierische Seren können verschiedene Sialinsäure-Glykane enthalten, die an die Hämagglutinine oder HAs von Influenzaviren binden und die Bindung von Influenza-spezifischen Anti-HA-Antikörpern hemmen können. Daher ist es notwendig, alle tierischen Seren vor den MN-Assays RDE-zu behandeln, um diese unspezifischen viralen HA-Bindemittel in den Serumproben zu entfernen.
>2. Passage der MDCK-SIAT1 Zellkultur
HINWEIS: Alle Zellkulturen müssen in einer biologischen Sicherheitswerkbank durchgeführt werden, um eine Kontamination zu verhindern.
- Das Zellkulturmedium wird in 162 cm2 Kolben von der Zellmonoschicht dekantiert. Trypsinisieren Sie die Zellen, indem Sie die Monoschicht mit Trypsin-Ethylendiamin-Tetraessigsäure (EDTA) spülen. Fügen Sie 5 ml Trypsin-EDTA hinzu, um die Zellmonoschicht zu bedecken. Inkubieren bei 37 °C, 5% Kohlendioxid, CO2, bis sich die Monoschicht ablöst (5-10 min). Geben Sie 15 ml MDCK-SIAT1-Zellkulturmedium in jeden Kolben mit trypsinisierten Zellen und pipettieren Sie nach oben und unten, um die Zellen zu trennen.
- Verwenden Sie ein Hämozytometer und Trypanblau, um die Zellzahl und die Lebensfähigkeit zu bestimmen. Die Zellen werden in neue 162 cmgroße 2 Gewebekulturflaschen mit 30 ml Zellkulturmedien mit 2-2,5 x 106 Zellen/Kolben ausgesät und 2 Tage lang bei 37 °C mit 5 % CO2 zur Verwendung in TCID- und MN-Assays inkubiert. Zellen bei 4 - 5 x 106 Zellen/Kolben säen und bei 37°C mit 5 % CO2 2 Tage inkubieren für die Verwendung zur Virusvermehrung.
Anmerkung: Die Aussaatdichte kann angepasst werden, wenn kürzere oder längere Kulturzeiträume gewünscht werden. Für die Virusvermehrung sollten die Zellen eine Konfluenz von über 100 % erreichen. Für TCID- (Tissue Culture Infection Dose) und MN-Assays sollten die Zellen eine Konfluenz von 75 bis 95 % aufweisen (Abbildung 1).
>3. Vermehrung von A(H3N2)-Viren in MDCK-SIAT1-Zellen
HINWEIS: Ein (H3N2)-Virus kann entweder in 10 - 11 Tage alten embryonierten Hühnereiern gemäß dem Standardprotokoll oder in MDCK-SIAT1-Zellkulturen vermehrt werden. MDCK-SIAT1-Zellen sollten für die Virusimpfung eine Konfluenz von über 100 % erreichen. Virussaatgut kann mit mehreren Verdünnungen des Inokulums beimpft werden. Die Inokulumverdünnungen mit der besten Ernte-HA und Infektiosität können für weitere MN-Assays verwendet werden.
- Das Zellkulturmedium wird in 162 cm 2 Kolben von der Zellmonoschicht (>100 % Konfluenz) entfernt. Waschen Sie die Monoschicht zweimal mit 15 ml sterilem 0,01 M PBS, pH 7,2 und umkanten Sie.
- Markieren Sie 1 Kolben als Kontrolle und fügen Sie 20 ml Virusvermehrungsmedium hinzu. Der Kolben wird bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubiert. Lassen Sie diesen Kolben unberührt und verwenden Sie ihn zum Vergleich nach Tag 1 der Virusvermehrung.
- 10 ml steriles Virusvermehrungsmedium werden in den Kolben (die Kolben) gegeben und alle Kolben bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Tauen Sie ein Fläschchen mit Influenzavirus-Fond bei Raumtemperatur auf und legen Sie es dann auf Eis. Mit dem Virusvermehrungsmedium auf die Zielverdünnungen verdünnen.
Anmerkung: Die Zielverdünnungen können auf der Grundlage der HA-Titer der Virusbestände angepasst werden. Um ein verdünntes Inokulum im Maßstab 1:1000 herzustellen, fügen Sie 100 μl Virus zu 9,9 ml sterilem Virusvermehrungsmedium hinzu. Vorsichtig invertieren, 1 ml 1:100 Verdünnung auf 9 ml steriles Virusvermehrungsmedium entfernen und vorsichtig invertieren, um ein 1:1000 verdünntes Inokulum zu erhalten. Auf Eis legen.
- Entnehmen Sie alle Kolben mit Ausnahme des Kontrollkolbens aus dem Inkubator. Das Virusfortpflanzungsmedium wird aus dem Kolben bzw. den Kolben mit MDCK-SIAT1-Zellen entnommen und jeder Kolben mit 10 ml verdünntem Virus beimpft. Die Kolben werden 1 h lang bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert, wobei der Kolben bzw. die Kolben alle 15 Minuten gewechselt werden.
- 5 ml Inokulum aus dem Kolben (den Kolben) entnehmen und durch 15 ml Virusvermehrungsmedium ersetzen, das 1 μg/ml mit Tosylphenylalanylchlormethylketon behandeltes Trypsin (TPCK-Trypsin) enthält. Den Kolben (die Kolben) bei 37 °C, 5 % CO2 16-18 h inkubieren.
- Beobachten Sie nach der Inkubation über Nacht den/die Kolben(e) unter 100-facher Mikroskopvergrößerung und suchen Sie nach zytopathischen Effekten (CPE) auf die Zellen. 15-17 ml Virusüberstand aus dem Kolben (den Kolben) entnehmen und durch 15 bis 17 ml frisch zubereitetes Virusvermehrungsmedium ersetzen, das 2 μg/ml TPCK-Trypsin enthält.
- Die Kolben werden bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Überwachen Sie die CPE der Monoschicht (im Vergleich mit dem Zellkontrollkolben) und überprüfen Sie die HA periodisch (alle 4 h) mit 0,75 % gpRBC bis zur Ernte.
- Richten Sie eine HA 96-Well-Mikrotiterplatte ein. 50 μl 0,01 M PBS, pH 7,2 in die Vertiefungen A2 - A12 und B2 - B12 (Duplikate) und in die Vertiefungen H1 - H12 zur Kontrolle geben.
- Geben Sie 100 μl Virusüberstand zu A1 und A2 hinzu und führen Sie eine 2-fache serielle Verdünnung von A1 und B1 bis A12 und B12 durch. 50 μl nach dem Einmischen von A12 und B12 verwerfen. Geben Sie 50 μl 0,75 % gpRBCs in die Reihen A, B und H.
- Klopfen Sie auf die Platte und inkubieren Sie sie 1 h lang bei Raumtemperatur.
- Bestimmen Sie die HA des Virusüberstands, indem Sie die 96-Well-Mikrotiterplatte in einem Winkel von 45° bis 60° kippen.
- Leseplatten für die Hämagglutination; die höchste Verdünnung des Virus, die eine vollständige Hämagglutination erreicht, gilt als Endpunkt der HA-Titration für das spezifische Virus. Der Kehrwert der höchsten Virusverdünnung bei vollständiger Hämagglutination ist als HA-Titer des Virus zu erfassen.
Anmerkung: Die abgesetzten RBCs in Reihe H (Kontrollen) sollten anfangen zu "laufen" und aufgrund der Schwerkraft eine kleine Tropfenform bilden. Warten Sie, bis die RBCs in den Kontroll-Wells fertig ausgeführt werden, und lesen Sie dann die RBC-Tasten in den Virus-Titrations-Wells. Diejenigen, die Erythrozytenknöpfe aufweisen und "laufen", erreichen keine Hämagglutination. Lokalisieren Sie die höchste Verdünnung des Virus, die die Hämagglutination vollständig hemmt, als Endpunkt-HA-Titer des Virus.
- Ernten Sie das Virus, wenn die HA der Viruskultur ein Plateau erreicht oder die Viruskultur die Ziel-HA erreicht (z. B. >16 HA-Einheit), aber bevor die Zellmonoschicht beginnt, signifikante CPE zu zeigen.
- Der Überstand der Viruskultur wird bei 300 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert, um die Zelltrümmer zu pelletieren. Der geklärte Überstand mit der Virusernte wird in ein sauberes Röhrchen überführt. Der Überstand, der das Virus enthält, wird in sterile kryogene Einwegfläschchen abgefüllt und sofort bei -70 °C oder kälter eingefroren.
Anmerkung: Die für die MN-Assays verwendeten Virusbestände sollten einen hohen infektiösen Titer und minimale defekte Partikel aufweisen. Die Mindestverdünnung der Virusbestände zum Erreichen von 100 TCID50/50 μl für den MN-Assay beträgt 1:100.
Anmerkung: Die in den MN-Tests verwendeten Virusbestände sollten nicht aufgetaut und wieder eingefroren werden.
>4. Bestimmung der TCID des Virus
- Tag 1: Titration des Virus
- Tauen Sie ein Fläschchen mit dem Virus bei Raumtemperatur auf und legen Sie es sofort auf Eis.
- Testen Sie das Virus in zwei verschiedenen Anfangsverdünnungen: 10-2 und 10-3. Geben Sie 100 μl Virus auf 9,9 ml Virusverdünnungsmittel für eine 10-2-Verdünnung. Fügen Sie 1 ml 10-2-Verdünnung zu 9,0 ml Virusverdünnungsmittel für eine 10-3-Verdünnung hinzu.
- Geben Sie unter Verwendung von zwei Mikrotiterplatten (Platte 1 für 10-2-Verdünnung und Platte 2 für 10-3-Verdünnung) 100 μl Virusverdünnungsmittel in alle Vertiefungen mit Ausnahme von Spalte 1 der 96-Well-Mikrotiterplatte.
- Führen Sie 1/2 log10 Verdünnungen durch (10-2, 10-2,5, 10-3 usw.). Geben Sie 146 μl des Virus zu Beginn der Verdünnung in alle Vertiefungen in Spalte 1 und übertragen Sie 46 μl seriell von Spalte 1 bis Spalte 11 (Abbildung 2). Wechseln Sie die Pipettenspitzen zwischen den Vertiefungen. Nach dem Mischen der Säule 11 werden die Spitzen mit der 46-μl-Verdünnung verworfen.
- Verwenden Sie Spalte 12 als Cell Control (CC); sie enthält nur Virusverdünnungsmittel. 1 h bei 37 °C, 5 % CO 2 inkubieren.
- Tag 1: Präparation von MDCK-SIAT1-Zellen
Anmerkung: Die MDCK-SIAT1-Zellmonoschicht sollte eine Konfluenz von 75 - 95 % für TCID- und MN-Assays erreichen. Ein 162-cm-2-Kolben mit 95 % Konfluenz sollte genügend Zellen liefern, um ~ 4 - 5 Mikrotiterplatten zu säen.
- Waschen Sie die 75 - 95 % konfluente Monoschicht mit 20 mL PBS, um das FBS im Nährmedium zu entfernen. Trypsinisieren Sie die Zellen wie folgt.
- Spülen Sie die Monoschicht mit sterilem PBS und fügen Sie 7 ml Trypsin-EDTA hinzu, um die Zellmonoschicht zu bedecken. Den Kolben flach legen und bei 37 °C, 5 % CO2 inkubieren, bis sich die Monoschicht ablöst (ca. 5 - 10 Minuten). 7 ml Virusverdünnungsmittel werden in jeden Kolben gegeben, der die trypsinisierten Zellen enthält.
- Waschen Sie die Zellen mit Virusverdünnungsmittel, um das FBS zu entfernen.
- Pipettieren Sie vorsichtig auf und ab, um die Zellen zu trennen. Übertragen Sie die Zellen in ein konisches 50-ml-Röhrchen; Füllen Sie das Röhrchen mit Virusverdünnungsmittel.
- Zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 485 x g. Dekantieren Sie das Virusverdünnungsmittel, ersetzen Sie es durch frisches 50 mL Virusverdünnungsmittel und zentrifugieren Sie es 5 min lang bei 485 x g. Dekantieren Sie das Virusverdünnungsmittel und ersetzen Sie es durch frisches Virusverdünnungsmittel (10 mL/Kolben), um das Pellet wieder zu suspendieren.
- Verwenden Sie ein Hämozytometer und Trypanblau, um die Zellzahl und Lebensfähigkeit zu bestimmen. Stellen Sie die Zellkonzentration mit dem Virusverdünnungsmittel auf 1,5 x 105 Zellen/ml ein.
- Geben Sie 100 μl verdünnte MDCK-SIAT1-Zellen in jede Vertiefung der Mikrotiterplatten (1,5 x 104 Zellen/Vertiefung) und decken Sie die Platten ab. Inkubieren bei 37 °C, 5 % CO2 für 18 - 20 h.
- Tag 2: ELISA
- Fixierung von Zellen
- Entfernen Sie das Medium von den Mikrotiterplatten. Waschen Sie jede gut mit 200 μl PBS. 300 μl kaltes 80%iges Aceton in jede Vertiefung geben und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Entfernen Sie das Fixiermittel und lassen Sie die Platten an der Luft trocknen.
- Elisa
- Primäre Antikörperzugabe
Anmerkung: Monoklonaler Anti-Influenza-A-NP-Antikörper sollte im Übermaß als primärer Antikörper im ELISA verwendet werden. Bestimmen Sie die optimale Antikörperverdünnung für jede Charge von Primärantikörpern, indem Sie Antikörpertitrationen in MN durchführen. Wählen Sie die primäre Antikörperkonzentration aus, die zu hoch ist und das beste Signal-Hintergrund-Verhältnis aufweist.
- Verdünnen Sie den monoklonalen Anti-Influenza-Antikörper A NP (Primärantikörper) auf die Zielkonzentration im Antikörperverdünnungsmittel (z. B. fügen Sie 30 μl Primärantikörper zu 30 ml Antikörperverdünnungsmittel hinzu, um eine Zielverdünnung von 1:1000 zu erreichen).
- Waschen Sie die Platten 3 Mal mit 300 μL Waschpuffer. Geben Sie 100 μl verdünnten Primärantikörper in jede Vertiefung. 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
- Sekundäre Antikörperzugabe
HINWEIS: Anti-Maus-Immunglobulin aus Ziege, IgG, konjugiert mit Meerrettichperoxidase (HRP), sollte im Übermaß als sekundärer Antikörper im ELISA verwendet werden. Bestimmen Sie die optimale Antikörperverdünnung für jede Charge von Sekundärantikörpern, indem Sie Antikörpertitrationen durchführen. Wählen Sie die Sekundärantikörperkonzentration im Überschuss und mit dem besten Signal-Hintergrund-Verhältnis.
- Verdünnen Sie das mit HRP-Antikörper konjugierte Anti-Maus-IgG (Sekundärantikörper) auf die Zielkonzentration im Antikörperverdünnungsmittel (z. B. 7,5 μl Sekundärantikörper zu 30 mL Antikörperverdünnungsmittel für eine Zielverdünnung von 1:4000
).
- Waschen Sie die Platten 3 Mal mit 300 μL Waschpuffer. Geben Sie 100 μl verdünnten Sekundärantikörper in jede Vertiefung. 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
- Substratzugabe und Plattenlesung
- Waschen Sie die Platten 5 Mal mit 300 μL Waschpuffer und klopfen Sie auf ein fusselfreies Tuch.
- Geben Sie 100 μl frisch vorbereitetes Substrat in jede Vertiefung und inkubieren Sie bei Raumtemperatur, bis die Farbentwicklung gesättigt ist und die optische Dichte (OD) der Zellkontrollwells 0,2 <.
- Geben Sie 100 μl Stopplösung in alle Vertiefungen. Lesen Sie den Außendurchmesser von Vertiefungen bei 490 nm mit einem Mikrotiterplatten-Spektralphotometer ab.
- TCID 50 Berechnung
- Berechnen Sie den Median OD490 der Zellensteuerelemente (Spalte 12).
- Betrachten Sie jede Testvertiefung mit einem OD490, der mehr als doppelt so hoch ist wie der Median OD490 der CC-Wells, als "positiv", andernfalls wird sie als "negativ" angesehen.
- Berechnen Sie die TCID50 des Virus mit der Reed-Muench-Methode.
- Bestimmen Sie die Anzahl der positiven und negativen Ergebnisse bei jeder Verdünnung.
- Berechnen Sie "kumulativ positiv", "kumulativ negativ", "Verhältnis" und "% positiv", wie in Tabelle 1 dargestellt.
- Berechnen Sie den "proportionalen Abstand" zwischen der Verdünnung mit >50 % Positivwerten und der Verdünnung mit <50 % Positivwerten wie folgt:
Anmerkung: Der Korrekturfaktor für die Verdünnung von 1/2 log beträgt 0,5. Beispiel: In Tabelle 1: (80 − 50)/(80 − 20) x 0,5 = 0,25
- Berechnen Sie die Virus-TCID50, indem Sie den proportionalen Abstand zur Verdünnung addieren, der > 50% positiv ergibt.
Anmerkung: In Tabelle 2 ist TCID50 beispielsweise 10-5+(-0,25) = 10-5,25. HINWEIS: Dies ist die TCID50 des Virus pro 100 μl (oder 10-5,25/100 μl).
- Berechnen Sie die Virusverdünnung. Für MN-Assays verdünnen Sie das Virus auf 200 TCID50/100 μl (entspricht 100 TCID50/50 μl pro Well).
Anmerkung: Im Beispiel in Tabelle 1 beträgt 1 TCID50 10-5,25 in 100 μL, und die Verdünnung zum Erreichen von 200 TCID50/100 μL beträgt 1:891 basierend auf den Berechnungen: 200 x 10-5,25 = 10-2,95 = 1/102,95 = 1/891
>5. MN-Assay mit MDCK-SIAT1-Zellen
- Tag 1: Test- und Kontrollserenvorbereitung und Plattenlayout
- Tauen Sie die Seren in einem 37 °C warmen Wasserbad auf und entfernen Sie sie sofort nach dem Auftauen. Aliquotieren Sie die Menge an Seren, die getestet werden muss; Für den Test mit einem Virus in einem Singulett werden mindestens 10 μl Originalseren benötigt. Testen Sie Seren nach Möglichkeit in Duplikaten.
- Die menschlichen Seren werden 30 min lang in einem 56 °C warmen Wasserbad wie in Schritt 1.12.1 hitzeinaktiviert. Legen Sie die Seren nach der Hitzeinaktivierung auf Eis und fügen Sie das Virusverdünnungsmittel zu den Seren hinzu, um eine Vorverdünnung von 1:10 zu erreichen.
- RDE-Behandlung und Vorverdünnung von tierischen Seren auf 1:10 zur Verwendung für Kontrollen gemäß 1.12.2.
Anmerkung: Aufgetaute und behandelte Seren für Mensch und Tier können nicht länger als 24 h bei 4 °C gelagert werden. Seren sollten gefroren bei -20 °C oder kälter gelagert werden, wenn vor dem Assay eine längere Lagerzeit erforderlich ist.
- Um mit einem Virus zu testen, geben Sie 100 μl 1:10 verdünnte Seren in die Spalten A1 bis A10 (Abbildung 3). Geben Sie 50 μl Virusverdünnungsmittel in die Zeilen B bis H, außer in den Spalten 11 und 12 (Abbildung 3). Führen Sie eine 2-fache serielle Verdünnung von den Reihen A bis H durch und verwerfen Sie die letzten 50 μl in Reihe H (Abbildung 3).
Anmerkung: Wenn mehrere Viren getestet werden sollen, können die Seren in Titerröhrchen verdünnt werden. Die Verdünnung des Serums zur Bestimmung des Serumtiters in Vertiefung A beträgt 1:10, Vertiefung B 1:20, Vertiefung C 1:40, Vertiefung D 1:80, Vertiefung E 1:160, Vertiefung F 1:320, Vertiefung G 1:640, Vertiefung H 1:1.280 (Abbildung 3).
- Für die Viruskontrolle geben Sie 50 μl Virusverdünnungsmittel in die Vertiefungen A12, B12, C12 und D12 (keine Seren). Für die Zellkontrolle geben Sie 100 μl Virusverdünnungsmittel in die Vertiefungen E12, F12, G12 und H12 (kein Virus, keine Seren).
- Für die Kontrollseren (z. B. Frettchenseren Kontrollen) geben Sie 100 μl verdünnte Kontrollseren in Vertiefung A Spalte 11 und 50 μl Virusverdünnungsmittel in die Vertiefungen B11 - H11. Seriell verdünnen.
- Decken Sie die Platten ab und inkubieren Sie sie bei 37 °C und 5 % CO2, bis sie für die Viruszugabe bereit sind.
- Tag 1: Virus-Zugabe
- Verdünnen Sie das Virus auf 100 TCID50/50 μl mit Virusverdünnungsmittel.
- Geben Sie 50 μl verdünntes Virus in alle Vertiefungen, mit Ausnahme von Spalte 11 auf den Rückentitrationsplatten (BT) und den Zellkontrollvertiefungen E12, F12, G12 und H12 auf allen Platten (Abbildung 3). Bei den Platten mit Kontrollseren in Spalte 11 fügen Sie das Virus in Spalte 11 hinzu.
- Rücktitration (BT)
- Fügen Sie ein BT in Spalte 11 eines Satzes doppelter Platten ein (z. B. Platten 1A und 1B). 50 μl Virusverdünnungsmittel in alle Vertiefungen in Spalte 11 geben. Geben Sie 50 μl des Virus zu 100 TCID50/50 μl in die erste Vertiefung (A11). Mischen Sie, indem Sie auf und ab pipettieren.
- Mischen Sie 50 μl und überführen Sie sie in aufeinanderfolgende Vertiefungen, um 2-fache Serienverdünnungen durchzuführen. Wechseln Sie die Pipettenspitzen zwischen den Vertiefungen, um eine Virusverschleppung zu vermeiden. 50 μl aus der Vertiefung H11 verwerfen.
- Geben Sie 50 μl Virusverdünnungsmittel in Spalte 11, um das endgültige Volumen auf 100 μl zu bringen. Klopfen Sie zum Mischen auf die Platten.
- Die Platten bei 37 °C, 5 % CO2 1 h inkubieren.
- Führen Sie die MDCK-SIAT1-Zelladdition an Tag 1 und den ELISA an Tag 2 durch, wie in den Schritten 4.2 und 4.3 beschrieben (auch in 5.3 und 5.4 beschrieben).
- Tag 1: MDCK-SIAT1-Zellzugabe
- Bereiten Sie die MDCK-SIAT1-Zellen wie in Schritt 4.2 beschrieben vor. Geben Sie 100 μl MDCK-SIAT1-Zellen in einer Menge von 1,5 x 105 Zellen/ml in jede Vertiefung (1,5 x 104 Zellen/Vertiefung). Die Platten bei 37 °C, 5 % CO2 18 - 20 h inkubieren.
- Tag 2: ELISA
- Nach der Inkubation über Nacht, am zweiten Tag, fixieren Sie die Zellen mit 80 % kaltem Aceton, wie in Schritt 4.3 beschrieben.
- Zugabe von primären Antikörpern
- Waschen Sie die Platten 3 Mal mit 300 μL Waschpuffer. Der monoklonale Anti-Influenza-Antikörper A NP (Primärantikörper) wird auf die optimale Konzentration verdünnt, die durch Titration in Antikörperverdünnungsmittel bestimmt wird (z. B. 30 μl Primärantikörper zu 30 ml Antikörperverdünnungsmittel für eine Zielverdünnung von 1:1000 hinzufügen).
HINWEIS: Pro Vertiefung sind 100 μl Primärantikörper erforderlich. ~10 mL werden pro Platte benötigt.
- Geben Sie 100 μl verdünnten Primärantikörper in jede Vertiefung. 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
- Sekundäre Antikörperzugabe
- Platten 3-mal mit 300 μL Waschpuffer waschen. Verdünnen Sie das an HRP-Antikörper konjugierte Ziegen-Anti-Maus-IgG (Sekundärantikörper) auf die Zielkonzentration im Antikörperverdünnungsmittel (z. B. 7,5 μl Sekundärantikörper zu 30 mL Antikörperverdünnungsmittel für ein Zielmolekül von 1:4000).
HINWEIS: Pro 96 Vertiefung sind 100 μl Sekundärantikörper erforderlich. ~10 mL werden pro Platte benötigt.
- Geben Sie 100 μl verdünnten Sekundärantikörper in jede Vertiefung. 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
- Substratzugabe und Plattenlesung
- Waschen Sie die Platten 5 Mal mit 300 μL Waschpuffer und klopfen Sie auf das fusselfreie Tuch.
- Geben Sie 100 μl frisch vorbereitetes Substrat in jede Vertiefung und inkubieren Sie bei Raumtemperatur, bis die Vertiefungen der Viruskontrolle einen OD490 = 0,8 - 3 erreichen, wobei die Zellkontrolle einen niedrigen Hintergrundwert von OD490 <0,2 erreicht.
- Geben Sie 100 μl der Stopplösung in alle Vertiefungen. Lesen Sie den Außendurchmesser von Vertiefungen bei 490 nm mit einem Mikrotiterplatten-Spektralphotometer ab.
- Datenanalyse
Anmerkung: Die MN-Berechnungen werden für jedes Blech einzeln ermittelt.
- Bestimmen Sie den neutralisierenden Antikörpertiter jeder Serumprobe.
- Berechnen Sie den OD490-Cutoff-Gehalt von 50 % Virusneutralisation für jede Platte mit der folgenden Gleichung:
Anmerkung: Dabei ist x = 50% des Neutralisations-Cutoffs. Die reziproke Serumverdünnung, die der höchsten Verdünnung mit OD490 von weniger als 50 % des Cutoffs (≥50 % Hemmung) entspricht, gilt als Neutralisationsantikörpertiter für diese Serumprobe (Abbildung 4).
- Überprüfen Sie, ob die Zellkontrollvertiefungen einen OD490 <0,2 und die Viruskontrollvertiefungen einen OD490 = 0,8 - 3 aufweisen.
- Überprüfen Sie die Infektiosität des Virus in jedem Assay (100x TCID50) anhand von Virus-BT. Der akzeptable Bereich von BT liegt bei 50, 100 oder 200 TCID. Wenn derselbe Cutoff-Wert wie in Schritt 4.4.2 definiert verwendet wird, sollte die höchste Virusverdünnung in der BT-Säule mit einem OD über dem Cutoff-Wert in den Vertiefungen E11, F11 und G11.
Anmerkung: Die Serum-Positivkontrollen sollten Titer ergeben, die innerhalb des 2-fachen der in den vorangegangenen Tests erzielten Werte liegen. Die OD490 der negativen Serumkontrolle sollte ähnlich wie die für die Viruskontrolle beobachtete sein.
