Ein Assay zum Nachweis von oxidativen Bursts in Arabidopsis-Blattscheiben nach Immunauslösung

Zusammenfassung

Quelle: Bredow, M., et al. Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. (2019)

Dieses Video zeigt einen Assay zur Messung des oxidativen Ausbruchs in Arabidopsis-Blättern nach Immunauslösung. Blattscheiben, die aus Pflanzenblättern geschnitten werden, werden mit bakteriellen Peptiden inkubiert, die als mikrobenassoziierte molekulare Muster oder MAMPs fungieren. Nach dem Nachweis der MAMPs induzieren Pflanzenzellen die Produktion von extrazellulärem ROS, das mit Hilfe eines Chemilumineszenz-Assays nachgewiesen wird.

Protokoll

>1. Nachweis von ROS-Bursts in Arabidopsis-Blattscheiben nach Immunauslösung

1. Pflanzenwachstum und -pflege.
   1. Um die Keimung zu synchronisieren, schichten Sie die Arabidopsis-Samen, indem Sie etwa 50 Samen in 1 ml sterilem 0,1%-Agar [w/v] suspendieren und 3-4 Tage lang bei 4 °C (ohne Licht) lagern.
      Anmerkung: Stratifizieren Sie eine Wildtyp-Hintergrundkontrolle (z. B. Col-0) und Genotypen mit hoher und niedriger Immunleistung (z. B. cpk28-1 bzw. bak1-5), um als interne Kontrollen zu dienen.
   2. Säen Sie die Samen auf den Boden und keimen Sie unter normalen Kurztagbedingungen (22 °C, 10 h Licht, 150 μE/m²/s Lichtintensität und 65-70 % relative Luftfeuchtigkeit).
   3. Nach ca. 7 Tagen die einzelnen Sämlinge mit einer Pinzette in neue Töpfe umpflanzen, die mindestens 4 cm voneinander entfernt sind, um eine vollständige Rosettenentwicklung zu ermöglichen. Verpflanzen Sie 6-12 Sämlinge pro Genotyp und kehren Sie zu den üblichen Kurztagbedingungen zurück. Gießen und düngen Sie die Pflanzen regelmäßig (1 g/L 20-20-20 Dünger alle 2 Wochen).
2. Sammeln Sie die Blattscheiben in 96-Well-Platten, um sie über Nacht wiederherzustellen.
   1. Verwenden Sie 4-5 Wochen nach der Keimung (Abbildung 1A) einen scharfen 4-mm-Biopsiestanzer, um eine Blattscheibe pro Pflanze zu entfernen, wobei Sie die Mittelvene vermeiden und darauf achten, die Verwundung zu begrenzen (Abbildung 1B). Legen Sie die Blattscheiben mit der adaxialen Seite nach oben in eine unbenutzte 96-Well-Luminometerplatte mit 100 μl doppelt destilliertem Wasser (ddH₂O), um ein Austrocknen zu verhindern (Abbildung 1C). Bei der Beurteilung mehrerer Emitoren ist bei jeder Hervorruferbehandlung 1 Blattscheibe vom selben Blatt zu entfernen.
      Anmerkung: Proben Sie Blätter, die vollständig ausgebreitet sind, drittes bis fünftes von der Spitze der Rosette, und ungefähr die gleiche Größe und das gleiche Alter haben, um die Variabilität zu begrenzen. Wenn möglich, schneiden Sie die Blattscheiben vor der Rückgewinnung über Nacht mit einer Rasierklinge in zwei Hälften, da dies die Oberfläche, die der Auslöselösung ausgesetzt ist, vergrößert.
   2. Über Nacht bei Raumtemperatur zurückstellen, um die Interferenz von ROS zu vermeiden, die durch das Aufwickeln während der Laubscheibensammlung entstehen. Decken Sie die Platten mit einem Deckel ab, um eine Verdunstung zu verhindern.
3. Führen Sie die Elikatorbehandlung durch und messen Sie die ROS-Produktion.
   1. Programmieren Sie den Plattenleser vor der Zugabe der Reaktionslösung, da dies die Zeit zwischen der Initiierung des ROS-Bursts und den ersten aufgezeichneten Messungen verkürzt. Verwenden Sie eine kommerzielle Software, die für den Plattenleser geeignet ist. Klicken Sie in unserem Fall (siehe Inhaltsverzeichnis) auf Einstellungen und wählen Sie die LUM96-Patrone und den kinetischen Lesetyp aus. Klicken Sie auf die Kategorie Lesebereich, und ziehen Sie, um eine Teilmenge der Vertiefungen oder die gesamte Platte auszuwählen, die gelesen werden soll. Legen Sie auf der Registerkarte PMT und Optik die Integrationszeit auf 1.000 ms fest. Legen Sie auf der Registerkarte Timing die Gesamtlaufzeit auf 40-60 min und das Intervall auf 2 min fest.
   2. Entnehmen Sie Wasser aus jeder Vertiefung mit einer Mehrkanalpipette.
      Anmerkung: Durchstechen Sie die Blattscheiben nicht, da dies zu Verletzungsbelastungen führen und zu variableren ROS-Ausgängen führen kann.
   3. Bereiten Sie eine Reaktionslösung her, die 100 μM Luminol, 10 μg/ml Meerrettichperoxidase (HRP) und die gewünschte Konzentration des Elicitors (z. B. elf18 bei 1 nM, 10 nM, 100 nM oder 1.000 nM) in sterilem ddH₂O enthält, indem Sie 10 ml Lösung für eine 96-Well-Platte verwenden.
      Anmerkung: Lyophilisierte Peptide werden in sterilem H₂O in niedrig bindenden Röhrchen gelöst, um eine 10 mM Brühe herzustellen, in flüssigem N₂ schockgefroren und bei -80 °C gelagert. Nach der Verwendung werden die Bestände in sterilem H₂O verdünnt, um ein Arbeitsmaterial von 100 μM zu erhalten, und bei -20 °C gelagert.
   4. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 100 μl des Reaktionsgemisches in jede Vertiefung zu dosieren, und geben Sie die Lösung gleichzeitig auf alle Blattscheiben derselben Behandlung. Fügen Sie für jeden Genotyp eine Kontrollreaktion (kein Elictor) hinzu, um die basalen ROS-Spiegel ohne Hervorrufung zu beurteilen. Messen Sie sofort die Lichtemission für alle Wellenlängen im sichtbaren Spektrum mit einem Mikroplatten-Reader.
      Anmerkung: Bereiten Sie die Reaktionslösung vor und tragen Sie sie bei schwachem Licht auf, da Luminol und HRP lichtempfindliche Reagenzien sind. Bewahren Sie die Reagenzien auf Eis oder bei -20 °C auf, es sei denn, sie werden verwendet.
   5. Messen Sie die Lichtemission mit einer Integrationszeit von 1.000 ms in 2-Minuten-Intervallen über einen Zeitraum von 40-60 Minuten in einem Mikroplatten-Reader, um den dynamischen oxidativen Ausbruch zu erfassen (Abbildung 1D).
      Anmerkung: Nutzen Sie eine längere Integrationszeit, um die Assay-Empfindlichkeit zu verbessern und gleichzeitig sicherzustellen, dass alle Proben in einer 96-Well-Platte innerhalb eines Intervalls gemessen werden können.

Ergebnisse

Abbildung 1. Luminol-basierter oxidativer Burst-Assay nach Immuninduktion in Arabidopsis. (A) Bauen Sie Pflanzen 4-5 Wochen lang unter Kurztagbedingungen auf Erde an. (B) Verwenden Sie einen 4-mm-Biopsiestanzer, um Blattscheiben von jeder Pflanze zu sammeln und über Nacht in ddH2O zu erholen. (C) Fügen Sie Reaktionslösung hinzu (100 μM Luminol, 10 μg/ml HRP und die gewünschte Konzentratio...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
20-20-20 Dünger	Pflanzen-Prod	Artikel-Nr.: 10529	Mischen Sie 1 g/l in Wasser und tragen Sie es alle 2 Wochen auf die Pflanzen auf, um ein optimales Wachstum zu erzielen.
4 mm Biopsie-Stanze	Medizinischer Markt	232-33-34-P	Es kann auch ein Korkbohrer-Set mit einer Fläche von 0,125 cm^2 verwendet werden.
BioHit mLine Mechanical 12 Mehrkanalpipette (30-300 μl)	Schneidermuskel	Artikel-Nr.: 725240	Jede Mehrkanalpipette kann verwendet werden, bei Bedarf auch eine einzelne Pipette.
elf18 (ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG)	EZ Biolab	CP7211	Lagern Sie 10 mM Stammpeptid bei -80 °C in Röhrchen mit geringer Proteinbindung. Nach dem Auftauen 100 μM Arbeitsmaterial bei -20 °C lagern.
Zange	Fisher Scientific	Tel.: 22-327379
Meerrettich-Peroxidase	Sigma-Aldrich	Nr. P6782	In reinem Wasser auflösen. Bei -20 °C und lichtgeschützt lagern.
Luminol	Sigma-Aldrich	Nr. A8511	In DMSO auflösen. Bei -20 °C und lichtgeschützt lagern.
Murisage und Skoog Basalsalze	Cedarlane Labore	MSP09-100LT	Bei 4C lagern.
Boden	SunGrow Gartenbau	Sonnenschein Mix #1	Auch andere Bodenarten können für den Anbau von Arabidopsis verwendet werden. Beim Befüllen der Töpfe mit Wasser mischen.
SpectraMax Paradigm Multi-Mode-Mikroplatten-Reader mit LUM-Modul	Molekulare Bauelemente		Für diese Assays kann jedes Platten-Reader verwendet werden, das Lumineszenz nachweisen kann.
96-Well-Platten aus weißem Polystyrol	Fisher Scientific	Tel.: 07-200-589