Messung der immuninduzierten Hemmung des Sämlingswachstums

Zusammenfassung

Quelle: Bredow, M. et al., Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. (147),(2019).

Dieses Video zeigt den Assay zur Hemmung des Sämlingswachstums in der Pflanze Arabidopsis thaliana. Der Einfluss einer erhöhten Konzentration des Immunpeptid-Elicitors auf das Wachstum der Sämlinge wird bestimmt.

Protokoll

>1. Assay zur Hemmung des Sämlingswachstums

1. Samen sterilisieren und auf Murashige und Skoog (MS) Platten säen.
   1. Bereiten Sie steriles halbstarkes (0,5x) MS-Medium (2,16 g/l) mit 0,8 % Agar [w/v] vor. Gießen Sie das Medium in Platten (90 x 15 mm) in einer Laminar-Flow-Haube.
   2. Sterilisieren Sie ca. 100 Samen in einem Mikrozentrifugenröhrchen, indem Sie sie 2 Minuten lang mit 1 ml 70%igem Ethanol waschen und durch Aspiration entfernen. 1 ml 40%iges Bleichmittel hinzufügen und 17 Minuten lang bei Raumtemperatur sanft schaukeln. Entfernen Sie das Bleichmittel durch Aspiration und waschen Sie es dreimal 5 Minuten lang in 1 ml sterilem Wasser. Resuspendieren Sie in 1 mL sterilem 0,1 % agar.
      Anmerkung: Alternativ können Sie ein Sterilisationsprotokoll für Saatgut mit Chlorgas verwenden24.
   3. Säen Sie ca. 100 Samen pro Genotyp mit einer Pipette auf MS-Agarplatten und verschließen Sie sie mit Mikroporenband in einer Laminar-Flow-Haube.
      Anmerkung: Vermeiden Sie es, die Samen in unmittelbarer Nähe zu platzieren, da dies das spätere Umpflanzen der Sämlinge erschwert.
   4. Stratifizieren Sie die Samen, indem Sie die Platten 3-4 Tage lang bei 4 °C (ohne Licht) aufstellen, um die Keimung zu synchronisieren (Abbildung 1A).
2. Verpflanzen Sie die Sämlinge in 48-Well-Platten, die Immun-Elicitor-Peptide enthalten.
   1. Nach der Schichtung die Platten unter Kurztagbedingungen (22 °C, 10 h Licht, 150 μE/m²/s Lichtintensität und 65-70 % relative Luftfeuchtigkeit) für 3-4 Tage in Licht bringen, um die Keimung zu ermöglichen.
   2. Bereiten Sie in einer Laminar-Flow-Haube Elicitor-Peptidverdünnungen (0 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM und 1.000 nM) in sterilen 0,5x MS-Flüssigmedien mit 1 % Saccharose [w/v] vor, wobei 25 ml MS für jede 48-Well-Platte verwendet werden. Bereiten Sie die Platten vor, indem Sie 500 μl flüssiges MS-Medium oder MS-Medium mit Peptiden pro Vertiefung pipettieren. Falls verfügbar, verwenden Sie eine Wiederholungspipette für die Plattenvorbereitung, um den Vorgang zu beschleunigen.
      Anmerkung: Für jeden Genotyp sollten Sämlinge in MS ohne Elicitor gezüchtet werden, um inhärente Unterschiede im Sämlingswachstum zu berücksichtigen.
   3. Mit einer sterilen Pinzette wird vorsichtig ein Sämling der gleichen Größe und des gleichen Alters in jede Vertiefung umgepflanzt, wobei darauf geachtet wird, dass der Sämling nicht beschädigt oder die Wurzel gebrochen wird und dass die Wurzel in Medien getaucht wird. Für jeden Genotyp transplantieren Sie mindestens 6-8 Sämlinge in jede Peptidverdünnung (Abbildung 1B).
      Anmerkung: Umtopfen Sie die Sämlinge 4 Tage nach der Keimung, da kurze Wurzeln leichter zu manipulieren sind und ältere Sämlinge weniger optimale Ergebnisse liefern können.
   4. Versiegeln Sie die Platten mit Mikroporenband und bringen Sie sie unter Standardbedingungen für kurze Tage (22 °C, 10 h Licht, 150 μE/m²/s Lichtintensität und 65-70 % relative Luftfeuchtigkeit) wieder zum Licht. Lassen Sie die Sämlinge 8-12 Tage lang wachsen.

>2. Bestimmen Sie die prozentuale Wachstumshemmung.

1. Entferne die Sämlinge vorsichtig von 48-Well-Platten und trockne sie, indem Du sie auf ein Papiertuch tupfst. Wiegen Sie Setzlinge auf einer Analysewaage und notieren Sie Werte. Falls verfügbar, verwenden Sie eine Analysewaage mit USB-Ausgang, um neue Gewichtswerte in einer Tabelle aufzuzeichnen. Machen Sie vor dem Wiegen der Sämlinge ein Foto, um die Wachstumshemmung visuell darzustellen (Abbildung 1C).
2. Bestimmen Sie die prozentuale Wachstumshemmung von mit Eliminatoren behandelten Sämlingen im Vergleich zu Sämlingen, die bei MS gezüchtet wurden, nur wie folgt:
   
3. Zeichnen Sie Daten mithilfe eines Balkendiagramms mit Standardfehlerbalken oder mithilfe eines Box-and-Whisker-Diagramms, um die interexperimentelle Varianz besser darzustellen.

Ergebnisse

Abbildung 1. Elicitor-induzierter Assay zur Hemmung des Sämlingswachstums in Arabidopsis. (A) Säen Sie die Sämlinge auf MS-Agar und wachsen Sie 3-4 Tage lang unter normalen Kurztagbedingungen. (B) Sämlinge auf 48-Well-Platten umpflanzen, die MS-Medium oder MS mit unterschiedlichen Konzentrationen von elf18 enthalten. (C) Nach 8-12 Tagen beurteilen Sie die Größe des Sämlings visuell und me...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Sterile 8-Well-Platten mit Deckel	Sigma-Aldrich	CLS3548
Analysenwaage mit Draft Sheid	VWR	VWR-225AC	Jedes Standard-Analysenmaß kann für Wachstumsinibitions-Assays verwendet werden, jedoch ist eine direkte Computerausgabe optimal.
BioHit mLine Mechanical 12 Mehrkanalpipette (30-300 μl	Schneidermuskel	Artikel-Nr.: 725240	Jede Mehrkanalpipette kann verwendet werden, bei Bedarf auch eine einzelne Pipette.
elf18 (AcSKEKFERTKPHVNVGTIG)	EZ Biolab	CP7211	Lagern Sie 10 mM Stammpeptid bei -80 °C in Röhrchen mit geringer Proteinbindung. Nach dem Auftauen 100 μM Arbeitsmaterial bei -20 °C lagern.
Murisage und Skoog Basalsalze	Cedarlane Labore	MSP09-100LT	Bei 4 Grad Celsius lagern.
96-Well-Platten aus weißem Polystyrol	Fisher Scientific	Tel.: 07-200-589

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