HINWEIS: Das Protokoll ist auf verschiedene Pflanzengewebe anwendbar. Reisscheide und Blattscheiben wurden in diesem Protokoll für den ROS-Nachweis nach PAMP-Auslösung verwendet. Da sich die Unterschiede hauptsächlich aus der Probenahmemethode ergeben, werden im Folgenden nur die gängigen Verfahren beschrieben, wobei bei Bedarf spezifische Schritte genannt werden.
>1. Gewebevorbereitung und -vorbehandlung
- Reisscheide
- Schneiden Sie die Scheide von 10 Tage alten Reissämlingen mit einer scharfen Rasierklinge oder einer chirurgischen Klinge in 3 mm große Segmente zur Vorbehandlung 1 Tag vor dem ROS-Assay (Abbildung 1B).
- Fünf Mantelsegmente werden in einer einzelnen Vertiefung einer 96-Well-Mikrotiterplatte mit 100 μl doppelt destilliertem Wasser (ddH2O) für 10-12 Stunden im Dunkeln bei 25 °C platziert, wodurch die durch Wundverletzungen verursachte Ionenleckage und Abwehrreaktionen nachlassen können (Abbildung 2).
Anmerkung: Die Achtfalt der Schnitte ist ein wichtiger Schritt, um hochgradig reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Verschieben Sie die Segmente vorsichtig. Nehmen Sie keine zusätzlichen Schnitte oder Wunden an den Segmenten vor, da dies eine Ursache für Datenabweichungen sein könnte. Grundsätzlich muss jeder Test mindestens fünf Wiederholungen enthalten, da die Variation des ROS-Wertes groß ist. Je mehr Replikate festgelegt sind, desto zuverlässiger sind die Daten.
- Blattscheibe
- Schneiden Sie die Blattscheiben (4 mm Durchmesser) von 4-6 Wochen alten Reispflanzen mit einer Biopsie-Stanze mit einem Kolben ab. Schneiden Sie die Blattscheiben immer aus dem mittleren Drittel des zweiten Blattes (von oben nummeriert) der Haupthacke, um Datenabweichungen zu reduzieren (Abbildung 1C).
- Eine Blattscheibe wird zur Vorbehandlung 10-12 Stunden lang in eine einzelne Vertiefung einer 96-Well-Mikrotiterplatte mit 100 μl ddH2O gelegt, wodurch die wundbedingten Reaktionen abgeschwächt werden können, da diese die Induktion von ROS durch PAMPs beeinträchtigen könnten (Abbildung 2).
Anmerkung: Betätigen Sie die Blattscheiben vorsichtig. Nehmen Sie im Experiment keine zusätzlichen Schnitte oder Wunden an den Discs vor, da dies zu Datenabweichungen führen könnte. Die Induktion von ROS erfolgt meist aus den Zellen der Schnittkante, da die Oberflächen des Reisgewebes (Blätter oder Scheiden) mit hydrophoben Schichten bedeckt sind. Nur die Zellen der Schnittkanten sind in Kontakt mit der Erhebungslösung (siehe Diskussionsteil).
- Lassen Sie alle Blattscheiben mit der abaxialen Oberfläche nach oben in den Vertiefungen einer Mikrotiterplatte zur Wasservorbehandlung schwimmen, um Schwankungen auf der Blattseite zu vermeiden.
>2. Vorbereiten der Erhebungslösung
- L-012-Pulver wird in 20 mM (6,23 mg/ml) wässriger Lösung mit ddH2O gelöst, um die Stammlösung herzustellen. Verdünnen Sie dann die Stammlösung mit 50 mM Tris HCl-Puffer (pH 7,5), um die Arbeitslösung in der Endkonzentration von 500 μM L-012 herzustellen. Halten Sie die Stammlösung vor der Verwendung gefroren und verdünnen Sie sie mit der Arbeitslösung.
- Bereiten Sie die Ausführlösung vor, die PAMP, L-012 und Meerrettichperoxidase (HRP; 10 mg/ml in ddH2O) enthält. Für eine 10-ml-Auslösung, mischen Sie 9,4 ml 50 mM Tris HCl (pH 7,5) Lösung, 400 μl der L-012-Lösung, 100 μl HRP und 100 μl flg22 (PAMP; 10 mM in ddH2O). Für die Negativkontrolle werden 100 μL ddH2O anstelle von PAMP.
Anmerkung: Bewahren Sie die vorbereiteten Klärlösungen bei Raumtemperatur auf, um Kältestress für das Reisgewebe zu vermeiden. Bei Bedarf können auch andere PAMPs zur Behandlung verwendet werden, wie z. B. Chitin (20 ng/ml in der Endkonzentration). Da L-012 lichtempfindlich ist, decken Sie alle Röhrchen mit der L-012-Lösung mit Aluminiumfolie ab.
>3. Starten der Software und Einrichten des Protokolls mit dem referenzierten Mikroplatten-Reader (siehe Materialtabelle)
HINWEIS: Es dauert einige Zeit, die Parameter der Mikroplatten-Reader-Software einzurichten. Es wird empfohlen, die Maschine und das Protokoll vorzubereiten (ein Klick, um fortzufahren), bevor Sie die Erhebungslösung hinzufügen.
- Starten Sie die Software. Klicken Sie auf die Schaltfläche Experimente, um ein neues Protokoll zu erstellen oder ein vorhandenes Protokoll zu verwenden.
- Klicken Sie im Pop-up-Fenster auf Prozedur, um die Platte einzurichten. Wählen Sie die Wells aus der Platte aus, die überwacht werden sollen.
- Klicken Sie auf Kinetic starten, um die Gesamtlaufzeit und das Leseintervall festzulegen. Legen Sie die Laufzeit auf 35 Minuten oder länger fest, abhängig von den experimentellen Anforderungen. Um so häufig wie möglich Messwerte zu erhalten, wählen Sie Minimales Intervall aus. Wählen Sie für die Integrationszeit je nach Signalintensität 1 s oder länger.
HINWEIS: Das Leseintervall hängt von der Anzahl der Abtastungen und der Dauer der Signalintegration ab.
- Klicken Sie auf Validieren | OK, um die Einstellungen zu bestätigen.
- Klicken Sie im Popup-Fenster auf Neue Platte erkennen und warten Sie, bis die Software das Dialogfeld für die Lastplatte anzeigt. Legen Sie die zu prüfende Platte auf den Träger.
- Halten Sie hier an, um zu warten, bis das Erhebungssystem eingerichtet ist (im nächsten Abschnitt). Sobald das Erhebungssystem bereit ist, klicken Sie auf Ausführen, um die Messung zu starten.
>4. Einrichtung des Erhebungssystems und Messung der Echtzeit-ROS-Produktion
Entfernen - Sie das ddH2O vorsichtig aus den Vertiefungen, in denen sich das vorbehandelte Gewebe befindet, und vermeiden Sie dabei Gewebeschäden oder Austrocknung.
- Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 200 μl der Erhebungslösung in die Vertiefungen mit dem Gewebe zu geben.
- Zum Mischen vorsichtig schütteln. Klicken Sie auf Ausführen, um die Erkennung zu starten.
Anmerkung: Bei der PAMP-Behandlung reagiert das Pflanzengewebe und produziert sehr schnell ROS. Daher wird empfohlen, zuerst die Negativkontrolle ohne PAMP zu behandeln, um die Operationszeit bei mehreren Behandlungen zu verkürzen. Operieren Sie so schnell wie möglich, um die Verzögerung zwischen den Behandlungen zu reduzieren. Je kürzer die Zeit zwischen der Zugabe der Erhebungslösung und dem Beginn der Detektion ist, desto besser ist die Erfassung wichtiger experimenteller Daten.
