Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
>1. Isolierung mononukleärer Zellen aus dem peripheren Blut
- Gewinnung von menschlichem Vollblut von einem gesunden Spender oder einem Patienten durch Venenpunktion unter Verwendung von Vacutainern, die Säure-Citrat-Dextrose (ACD)-Antikoagulans enthalten (Röhrchen mit gelbem Aufsatz).
Anmerkung: Vollblut kann in ACD bei Raumtemperatur (18-22 °C) bis zu 36 Stunden gelagert werden, bevor mit dem nächsten Schritt fortgefahren wird. Normalerweise reichen 1-2 10-ml-Vacutainer-Röhrchen mit Vollblut für den Assay aus.
- Verdünnen Sie das Vollblut 1:1 v/v in warmem, vollständigem RPMI-Medium (RPMI-1640, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum, 20 mM HEPES und 0,01 mg/ml Gentamicin).
- Isolieren Sie mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) aus dem verdünnten Vollblut mittels Dichtegradientenzentrifugation, wie vom Hersteller empfohlen (siehe Materialliste). Schichten Sie das verdünnte Blut sehr langsam über den Dichtegradienten (erwärmt auf Raumtemperatur, 18-22 °C).
Anmerkung: Minimieren Sie die Vermischungsmenge an der Grenzfläche für eine optimale Trennung des Blutes, indem Sie das Blutgemisch vorsichtig tropfenweise schichten oder eine Pipette verwenden.
- Lassen Sie das Blutgemisch langsam über die Oberseite des Dichtegradienten schichten, indem Sie die Pipettenspitze nahe am Dichtegradienten platzieren und das Blutgemisch sehr langsam an der Seite des Röhrchens herunterlaufen lassen.
- Je nach Umfang des Experiments schichten Sie 10 ml Blutgemisch auf 3 ml Dichtegradient (in einem 15-ml-Röhrchen) oder 35 ml Blutgemisch auf 15 ml Dichtegradient (in einem 50-ml-Röhrchen). In der Regel ergeben 10 ml Vollblut 10 Millionen PBMCs, mit einigen Unterschieden von Spender zu Spender.
Anmerkung: Es ist sehr wichtig, dass es zu keiner Vermischung des Blutgemisches mit dem Dichtegradienten kommt. Das Blutgemisch sollte sich über den Dichtegradienten legen und langsam ansteigen, bis das gesamte Blut auf dem Dichtegradienten liegt.
- Das Schichtgemisch bei 700 x g 30 min ohne Bremsen zentrifugieren. Das zentrifugierte Gemisch sollte in 5 Schichten (von oben nach unten) getrennt werden: Plasma, Buffy Coat (mit PBMCs), Dichtegradientenmaterial, Granulozyten und Erythrozyten.
- Entnehmen und entsorgen Sie den größten Teil des Plasmas und entnehmen Sie den Buffy Coat (PBMC)-Inhalt vorsichtig mit einer Pasteur-Pipette und einem Saugkolben in ein neues 15-ml-Röhrchen.
Anmerkung: Die Entfernung der Buffy-Coat-Schicht erfolgt effektiv durch Saugen der Pasteur-Pipette, während eine kreisende Bewegung um die Außenseite der Schicht ausgeführt wird, wobei die Spitze der Pipette gegen das Röhrchen stößt.
- Waschen Sie die isolierten PBMCs dreimal in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit pH 7,3, indem Sie zwischen den Wäschen 10 Minuten lang (mit vollen Bremsen) bei 350 x g zentrifugieren. Rekonstituieren Sie das PBMC-Pellet in vollständigem RPMI-Medium. Je nach Größe des Pellets sind 3-7 mL Medium ausreichend.
- Zählen Sie die PBMC mit Trypanblau und einem Hämozytometer. Zählen Sie nur die Zellen, die nicht durch das Trypanblau gefärbt sind. Rekonstituieren Sie die PBMCs auf 1.750.000 Zellen/ml in einem vollständigen RPMI-Medium.
- 400 μl (700.000 Zellen) in jede Vertiefung eines 8-Kammer-Objektträgers geben. Inkubieren Sie den Objektträger in einem 37 °C großen, voll befeuchteten Gewebekultur-Inkubator (ergänzt mit 5 % CO2) für 1 h, damit die Monozyten/Makrophagen haften können.
>2. Vorbehandlung von adhärenten Monozyten
HINWEIS: Dieser Schritt ist nur notwendig, wenn nach Möglichkeiten gesucht wird, die Phagozytose zu hemmen oder zu verbessern.
- Behandeln Sie adhärente Monozyten mit einem oder mehreren Arzneimitteln oder Verbindungen, die von Interesse sind. Rekonstituieren Sie das/die Medikament(e) oder anderes Testmaterial in der gewünschten Konzentration unter Verwendung eines vollständigen RPMI-Mediums.
Anmerkung: Zum Beispiel werden typischerweise 200 μg/ml IVIG verwendet, um eine 95-100%ige Hemmung der Phagozytose bei der Verwendung menschlicher Monozyten zu erreichen.
- Der Überstand, der nicht adhärente Zellen aus dem 8-Kammer-Objektträger enthält, wird nach der 1-stündigen Inkubation (nach Schritt 1.6) aspiriert und verworfen. Ersetzen Sie es durch 400 μl eines Arzneimittels oder einer anderen Behandlung und inkubieren Sie es 1 h lang bei 37 °C.
- Beim Ansaugen und Wechseln von Lösungen im 8-Kammer-Objektträger ist darauf zu achten, dass der Fluss der Flüssigkeiten so gesteuert wird, dass schwach anhaftende Zellen nicht abheben. Arbeiten Sie außerdem mit nur 2-3 leeren Vertiefungen auf einmal und vermeiden Sie es, die Vertiefungen zu trocknen.
Anmerkung: In der Regel wird jede Behandlung in technischen Triplaten durchgeführt.
>3. Opsonisierung von R2R2 roten Blutkörperchen
HINWEIS: Opsonisierte R2R2 Erythrozyten werden als Positivkontrolle für FcγR-vermittelte Phagozytose verwendet. Naive R2R2 sollte in Alsever-Lösung (zur Verlängerung der Haltbarkeit) bei 4 °C bis zu 1 Monat gelagert werden. Die Lösung von Alsever wird im eigenen Haus hergestellt und besteht aus 0,8 % w/v Trinatriumcitrat (Dihydrat), 1,9 % w/v Dextrose, 0,42 % w/v Natriumchlorid und 0,05 % w/v Zitronensäure (Monohydrat). Wenn R2-R2-Zellen nicht verfügbar sind, können andere Rh-phänotypisierte Zellen, wie z. B.R1,R2,R1, R1,R1, r oderR2r, verwendet werden.
- Waschen Sie R2R2 (cDE/cDE) rote Blutkörperchen in PBS insgesamt dreimal durch Zentrifugation bei 350 x g für jeweils 5 min.
Anmerkung: Die Menge der benötigten RBCs hängt von der experimentellen Größe ab und kann zurückgerechnet werden. Waschen Sie immer eine überschüssige Menge an Erythrozyten, da Erythrozyten bei jeder Wäsche durch Lyse oder bei der Entfernung des Überstands verloren gehen. In einem Experiment mit 5 Behandlungen und 2 Kontrollen, die alle in technischen Triplakaten durchgeführt wurden, gibt es beispielsweise insgesamt 21 Wells. 21 Vertiefungen mit 400 μl/Vertiefung mit 1,25 % RBC-Gemisch zeigen an, dass 105 μl gepacktes, opsonisiertes RBC benötigt werden. 200 μl Erythrozyten sollten initial gewaschen und 150 μl opsonisiert werden, um sicherzustellen, dass eine ausreichende Menge an Erythrozyten für den Phagozytoseschritt vorhanden ist.
- Das gewaschene R2R2 Pellet wird mit 1:1 v/v polyklonalen Anti-D-Antikörpern aus Humanserum opsonisiert und 1 h bei 37 °C inkubiert, wobei intermittierend gemischt wird.
Anmerkung: Wenn polyklonale Anti-D-Antikörper nicht verfügbar sind, ist es möglich, monoklonale Anti-D-Antikörper zu verwenden, die im Handel erhältlich sind, oder Anti-D-Antikörper, die normalerweise zur Rh-Immunprophylaxe verwendet werden, die von Blutbanken oder Transfusionsdiensten bezogen werden können. Optimierungstests sollten zu Beginn der Einrichtung des Assays und immer dann durchgeführt werden, wenn viele nicht titerte polyklonale Antikörper oder auf einen monoklonalen Antikörper umgestellt werden. Dies dient dazu, die optimale Konzentration oder das optimale Volumen von Anti-D zu identifizieren, das für ein Antiglobulin-Testergebnis (IAT) zwischen 3+ und 4+ und ein Phagozytose-Ergebnis von 70-90 phagozytierten Erythrozyten pro 100 gezählten Monozyten erforderlich ist.
- Waschen Sie das opsonisierte R2R2 insgesamt dreimal in PBS mittels Zentrifugation bei 350 x g für jeweils 5 min.
Anmerkung: Die erfolgreiche Opsonisierung von R2R2 kann durch eine indirekte IAT bestätigt werden. Kurz gesagt, sekundäre polyklonale Anti-Human-Antikörper werden hinzugefügt, um primäre opsonisierende Antikörper auf Erythrozytenoberflächen zu binden, und das verstärkte Signal kann in Form einer Hämagglutination beobachtet werden. Ein detailliertes Herstellerprotokoll finden Sie in der Datei mit den ergänzenden Materialien.
- Rekonstituieren Sie das gewaschene R2R2 Pellet auf 1,25 % v/v mit einem vollständigen RPMI-Medium.
Anmerkung: Überschüssiges opsonisiertes R2R2 kann bis zu einer Woche in der Alsever-Lösung bei 4 °C gelagert werden.
>4. Fc-Rezeptor-vermittelte Phagozytose
- Aspirieren Sie das Arzneimittel oder den mittleren Überstand aus dem 8-Kammer-Objektträger und fügen Sie 400 μl des Gemischs von 1,25 % v/v R2R2 hinzu. 2 h bei 37 °C inkubieren.
- Entfernen Sie die Kammern nach 2 Stunden Inkubation mit den Adaptern des Herstellers. Tupfen Sie überschüssiges R2R2 auf ein Papiertuch ab. Achten Sie darauf, dass die Rutsche nicht austrocknet.
- Füllen Sie ein 100-ml-Becherglas mit PBS. Tauchen Sie den Objektträger ein und waschen Sie ihn, indem Sie ihn langsam hin und her bewegen (ca. 30-40 Hübe), um den Großteil des nicht phagozytierten R2R2 zu entfernen.
- Entfernen Sie die Folie aus dem PBS. Tupfen Sie überschüssiges PBS mit einem Papiertuch oder Taschentuch ab und trocknen Sie die Folie an der Luft.
- Befestigen Sie den luftgetrockneten Objektträger 45 s lang in 100% Methanol. Trocknen Sie dann die feste Rutsche an der Luft.
Anmerkung: Die Objektträger können mit einer anderen Methode fixiert werden, die besser mit der nachgeschalteten Färbung kompatibel ist, wie z. B. die Grünwald-Giemsa-Färbung21 oder die Wright-Giemsa-Färbung.
- Montieren Sie das Objektträger mit einem hausgemachten Elvanol-Montagemedium (oder einem anderen handelsüblichen Montagemedium) und fügen Sie Deckgläser hinzu.
Anmerkung: Elvanol-Eindeckmedium besteht aus 15 % w/v Polyvinylalkoholharz und 30 % v/v Glycerin in PBS. Die Mischung wird so lange erhitzt, bis sich das gesamte Harz aufgelöst hat und das Glycerin homogen vermischt ist. Dieses kann durch ein anderes handelsübliches Eindeckmedium ersetzt werden.
- Lassen Sie die Montierung über Nacht trocknen, bevor Sie sie quantifizieren.
>5. Quantifizierung der Phagozytose
- Quantifizieren Sie mit einem Phasenkontrastmikroskop und einer 40-fachen Objektivlinse manuell die Anzahl der phagozytischen Ereignisse, indem Sie mindestens 200 Monozyten und die Anzahl der phagozytierten R2R2 innerhalb dieser Monozyten zählen. Halten Sie einen Zähler in jeder Hand, um gleichzeitig die Anzahl der Monozyten und die Anzahl der phagozytierten R2R2 zu quantifizieren.
- Den durchschnittlichen phagozytären Index erhält man, indem man die Anzahl der phagozytierten R2R2 durch die Anzahl der Monozyten dividiert und mit 100 multipliziert. Geben Sie die Daten als Mittelwert (durchschnittlicher phagozytärer Index) ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) an.
