>1. Bereiten Sie die erforderlichen Reagenzien und Materialien vor
- Bereiten Sie phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit 2 % fötalem Rinderserum (FBS) vor ("Waschpuffer"). Bereiten Sie PBS mit 2 % fötalem Kälberserum (FCS) vor, das 0,1 % nichtionisches Detergens enthält ("Perm-Wash-Puffer"; siehe Materialtabelle). PBS mit 1,5 % Formaldehyd herstellen.
Anmerkung: Formaldehyd ist ätzend und potenziell krebserregend und muss mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung gehandhabt werden.
- Bereiten Sie PBS mit 2 % FBS und 0,5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) für die magnetische Zelltrennung ("MCS-Puffer") vor.
- Bereiten Sie 50 μg/ml Phalloidin-Fluorescein-Isothiocyanat (Phalloidin-FITC) in Dimethylsulfoxid (DMSO) vor. Bereiten Sie eine nukleare Färbung von 1 mg/ml (z. B. 1 mg/ml 7-Amino-Actinomycin D (7-AAD) in DMSO oder Bis-Benzimid-Farbstoff; siehe Materialtabelle) in DMSO vor. Bereiten Sie Fluorochrom-markierte Antikörper vor, die für die interessierenden Zellen und das bildgebende Durchflusszytometer geeignet sind.
- Gewinnung von tierischen Geweben (z. B. Lymphknoten und Milz) als Quelle für T-Zellen und allogenen tierischen Geweben (z. B. Milz und Knochenmark) als Quelle für antigenpräsentierende Zellen oder Vorläuferzellen.
- Bereiten Sie Zellkulturmedium vor (z. B. Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) 1640 oder Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % FBS), 50 μM 2-Mercaptoethanol, Penicillin und Streptomycin und erhalten Sie 24- und/oder 96-Well-Zellkulturplatten.
>2. Antigen-präsentierende Zellen (APCs) vorbereiten
HINWEIS: Theoretisch könnte jede APC-Population mit dieser Methode untersucht werden. Unreife dendritische Zellen (DCs) aus dem Knochenmark der Maus als APCs wurden in diesem Fall verklagt. Es gibt viele Protokolle, um diese Zellen zu erzeugen. Kurz gesagt, es wurde das folgende Protokoll verwendet.
- Spülen Sie das Knochenmark aus den Femuren und Tibias in RPMI 1640 oder DMEM.
- Führen Sie die suspendierten Zellen durch ein 70-μm-Zellsieb, um kleine Knochenstücke und Ablagerungen zu entfernen.
- Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation und lysieren Sie dann die roten Blutkörperchen mit einem Ammoniumchloridpuffer für 5 Minuten bei Raumtemperatur.
- Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation (400 x g, 5 min) und resuspendieren Sie das Zellpellet
.
- Waschen Sie die Zellen in 5 - 10 mL Waschpuffer, pelletieren Sie sie durch Zentrifugation (400 x g, 5 min) und suspendieren Sie das Zellpellet erneut.
- Anreicherung hämatopoetischer Vorläufer über eine Zelltrennsäule durch Markierung der Zellen mit biotinylierten Anti-CD3 (5 μg/ml), Anti-B220 (5 μg/ml), Anti-MHC Klasse II (1 μg/ml) und Anti-CD11b (5 μg/ml) Antikörpern.
- Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation (400 x g, 5 min) und suspendieren Sie das Zellpellet wieder.
- Inkubieren Sie die Zellen mit magnetischen Anti-Biotin-Mikrokügelchen (siehe Materialtabelle) bei 4 °C für 10 Minuten.
- Waschen und pelletieren Sie die Zellen (400 x g, 5 min) und suspendieren Sie sie erneut in 1 ml MCS-Puffer, bevor Sie die markierten Zellen mit einer großen magnetischen Zelltrennsäule mit positiver Selektion (LS) entfernen, die mit 3 ml MCS-Puffer grundiert und in ihren Magneten gelegt wurde. Waschen Sie die Säule 3 Mal mit 3 ml MCS-Puffer; Der Durchfluss enthält die gewünschten Zellen.
- Kultivieren Sie die Zellen, die die Säule passieren, 6 Tage lang in RPMI 1640 oder DMEM, ergänzt mit 2 ng/ml rekombinantem Maus-Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor (GM-CSF) und 2 ng/ml rekombinantem humanen transformierenden Wachstumsfaktor β1 (TGFβ1). Ersetzen Sie die Hälfte des Mediums alle 2 Tage durch ein frisches, vollständiges Medium, das 2 ng/mL GM-CSF und TGFβ1 enthält.
HINWEIS: Humanes TGFβ1 ist in Mauszellen aktiv. Mit diesen unausgereiften DCs wurden Daten generiert. Andere Zellen (z. B. B-Zellen und reife DCs) können als APCs geeignet sein, wurden aber in diesem Assay nicht getestet.
- DCs in 90 % Serum / 10 % DMSO kryokonservieren und in flüssigem Stickstoff lagern; am Tag der Anwendung wiederherstellen. Zählen Sie vor der Anwendung die Anzahl der lebensfähigen DCs in einem Hämozytometer unter Verwendung des Trypanblau-Ausschlusses. Das Zellpellet wird vor der Verwendung in Abschnitt 4 wieder in Kulturmedium mit der entsprechenden Dichte (siehe Schritt 4.1) suspendiert.
>3. T-Zellen vorbereiten
- Verwenden Sie negative Selektionsmethoden, um zu vermeiden, dass versehentlich aktivierende oder hemmende Signale an die Zellen übertragen werden.
HINWEIS: In diesem Beispiel werden CD4+ T-Zellen für die Analyse vorbereitet.
- Um CD4+ T-Zellen aus der Milz der Maus herzustellen, zerdrücken Sie die Milz mit dem Kolben einer Spritze durch ein 70-μm-Zellsieb. Waschen Sie das Zellsieb mit Waschpuffer.
- Die suspendierten Zellen werden durch Zentrifugation (400 x g, 5 min) pelletiert und anschließend die roten Blutkörperchen lysiert, indem das Pellet 5 min lang bei Raumtemperatur in einem Ammoniumchloridpuffer resuspendiert wird.
- Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation (400 x g, 5 min) und suspendieren Sie das Pellet wieder.
- Waschen Sie die Zellen in 5 - 10 mL Waschpuffer und Pellet durch Zentrifugation (400 x g, 5 min). Suspendieren Sie das Pellet wieder.
- Färben Sie die Zellen mit biotinylierten Antikörpern gegen CD8, Haupthistokompatibilitätskomplex der Klasse II (MHC II, 1 μg/ml) und CD19 (5 μg/ml). 10 min bei 4 °C inkubieren.
- Waschen Sie die Zellen in 10 mL Waschpuffer und Pellet durch Zentrifugation (400 x g, 5 min). Suspendieren Sie das Pellet wieder.
- Inkubieren Sie die Zellen mit magnetischen Anti-Biotin-Mikrokügelchen (siehe Materialtabelle) gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Waschen Sie die Zellen in 10 mL Waschpuffer und Pellet durch Zentrifugation (400 x g, 5 min) und suspendieren Sie das Pellet erneut.
- Resuspendieren Sie die Zellen in 1 mL MCS-Puffer und reichern Sie die CD4+ T-Zellen über einer magnetischen Zelltrennsäule an, die mit 3 mL MCS-Puffer auf einem Magneten grundiert ist. Waschen Sie die Säule 3 Mal mit 3 mL MCS-Puffer. Der Säulendurchfluss enthält die angereicherten T-Zellen.
- Mittels Standard-Durchflusszytometrie ist die Reinheit der T-Zellen anhand eines Aliquots der negativ selektierten Zellen zu beurteilen. Färben Sie die Zellen mit einem Fluorochrom-Streptavidin-Konjugat (zur Identifizierung von Biotin-markierten Zellen, die auf der Säule hätten entfernt werden sollen) und einem oder mehreren Antikörpern zur Identifizierung der interessierenden T-Zellpopulation (in diesem Fall CD4); Eine Reinheit von ≥85% ist akzeptabel.
- Zählen Sie die T-Zellen in einem Hämozytometer durch Trypanblau-Ausschluss (≥90 % Lebensfähigkeit ist akzeptabel).
HINWEIS: MCS-Puffer enthält EDTA, das vor dem Assay entfernt werden muss. Um dies zu erreichen, pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation (400 x g, 5 min) und waschen Sie sie in 1 mL Waschpuffer. Die Zellen werden erneut pelletiert (400 x g, 5 min) und in Kulturmedium mit der entsprechenden Dichte erneut suspendiert (siehe Schritt 4.1).
>4. T-Zellen und DCs gemeinsam inkubieren
- Säen Sie T-Zellen und DCs mit einem T:1:DC-Verhältnis in einer 24-Well- oder 96-Well-Zellkulturplatte. Stellen Sie sicher, dass das endgültige Kulturvolumen ≤500 μl für 24-Well-Platten oder ≤50 μl für 96-Well-Platten beträgt.
HINWEIS: Kleinere Volumina fördern Zell-Zell-Interaktionen und schaffen Platz für nachfolgende Fixierungspuffer.
- Passen Sie die genaue Zellzahl empirisch an, aber verwenden Sie als allgemeinen Anhaltspunkt 1 x 106 T-Zellen und 0,5 x 106 DCs pro Well (96-Well-Platte). Dies sollte als minimale Anzahl von Zellen angesehen werden, da die Verwendung von weniger Zellen die Zählung von Immunsynapsen erschwert.
- Um die Anzahl der Zellen zu erhöhen, richten Sie nach Schritt 5 (Fixierung) Replikationsvertiefungen und -pools ein.
HINWEIS: Beim Einrichten von Replikat-Wells ist es ratsam, zuerst DCs in allen Wells zu säen und dann T-Zellen in allen Wells zu säen. Dies minimiert Diskrepanzen in der Inkubationszeit zwischen den Wells.
- Die Platte 4 h bei 37 °C in einer Atmosphäre mit 5 % CO2 inkubieren.
>5. Zellen in der Platte fixieren
- Geben Sie das 3-fache des Kulturvolumens von 1,5 % Formaldehyd in PBS in jede Vertiefung und inkubieren Sie es 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Es ist wichtig, die Zellen zu fixieren, bevor sie von der Platte genommen werden, um die Störung der Zell-Zell-Interaktionen zu minimieren.
- Übertragen Sie die Zellen in der Platte in Röhrchen zum anschließenden Waschen und Färben. Reservieren Sie zu diesem Zeitpunkt zusätzliche Zellen für die Kontrolle einzelner Flecken. Abgesehen von diesen Kontrollen sollte die gesamte Kultur mit dem Antikörpercocktail gefärbt werden (siehe Schritt 4.1.1).
>6. Zellen färben
- Färbezellen in 100 μl Waschpuffer, der einen Cocktail der gewünschten Fluorochrom-konjugierten Antikörper enthält, 30 min lang bei Raumtemperatur lichtgeschützt färben.
HINWEIS: Der Cocktail enthält T-Zell-spezifische und APC-spezifische Antikörper. Fluorochrome sollten so gewählt werden, dass sie anhand der Konfiguration des bildgebenden Durchflusszytometers unterschieden werden können. In den hier gezeigten Experimenten wurden blaufluorophor-konjugiertes CD11b (5 μg/ml, siehe Materialtabelle) und APC-konjugiertes CD90.2 (5 μg/ml) verwendet.
- Die Zellen in 1 mL Waschpuffer waschen und 5 min bei 400 x g zentrifugieren. Den Überstand dekantieren. Resuspendieren Sie die Zellen in Perm-Wash-Puffer, der Phalloidin FITC bei 0,05-0,5 μg/ml enthält, und inkubieren Sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur und vor Licht geschützt.
HINWEIS: Phalloidin-FITC-Konzentrationen von etwa 0,1 μg/ml funktionieren gut für Mauszellen, aber es wird erwartet, dass die geeignete Konzentration je nach Lieferant, Zelltyp und bildgebendem Durchflusszytometer variiert.
- Waschen Sie die Zellen in 1 mL Dauerwelle/Waschpuffer und zentrifugieren Sie sie 5 Minuten lang bei 400 x g. Dekantieren Sie den Überstand. Resuspendieren Sie die Zellen in Perm/Waschpuffer, der Kernfarbstoff in der entsprechenden Konzentration enthält (z. B. ca. 25 μg/ml 7-AAD) und inkubieren Sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur vor Licht geschützt.
- Waschen Sie die Zellen in 1 mL Dauerwelle/Waschpuffer und zentrifugieren Sie sie 5 Minuten lang bei 400 x g. Dekantieren Sie den Überstand. Waschen Sie die Zellen einmal in Waschpuffer, pelletieren Sie sie und resuspendieren Sie sie in 50 - 100 μl Waschpuffer, indem Sie die Zellen in kleine, verschlossene Mikrozentrifugenröhrchen überführen.
- Fahren Sie sofort mit der Datenerfassung fort oder lagern Sie die Zellen bis zu mehreren Tage vor der Aufnahme lichtgeschützt bei 4 °C auf dem bildgebenden Durchflusszytometer.
HINWEIS: Zellen wurden auf diese Weise bis zu 7 Tage lang erfolgreich gelagert. Eine längere Lagerung ist möglich, wurde aber nicht getestet.
>7. Daten erfassen
- Initialisieren und konfigurieren Sie das bildgebende Durchflusszytometer gemäß den Anweisungen des Herstellers. Stellen Sie die Stabilität des Flow-Kerns sicher, bevor Sie Daten erfassen.
- Reservieren Sie einen Kanal für die Hellfeld-Bildaufnahme. Erfassen Sie Daten zur Kontrolle einzelner Flecken bei ausgeschaltetem Hellfeldkanal.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche "Laden" und setzen Sie ein Röhrchen mit einer vollständig gefärbten Probe (eine Probe, die mit allen erforderlichen Fluorochromen gefärbt wurde) in den Halter ein.
- Wählen Sie im "Arbeitsbereich"-Fenster ein neues Streudiagramm mit dem Seitenverhältnis über dem Bereich und den Gate-Unterstücken aus und erstellen Sie diese, bei denen das Seitenverhältnis nahe 1 liegt. Erstellen Sie für jeden verwendeten Kanal ein neues Streudiagramm (Intensität des Kanals auf der horizontalen Achse).
- Überprüfen Sie für jedes Fluorochrom die positive Population und passen Sie bei Bedarf die Laserspannung im Feld "Beleuchtung" an.
- Entladen Sie das Rohr und laden Sie das erste einfach gefärbte Rohr.
- Geben Sie im Feld "Erfassungseinstellungen" den Namen der Probe ein und legen Sie die Anzahl der Ereignisse fest, die erfasst werden sollen. Wenn es sich um einen einzelnen Fleck handelt (für die Kompensationskontrolle), sind 1.000 bis 2.000 Ereignisse ausreichend.
- Wählen Sie im Feld "Kanäle" die Kanäle aus, mit denen jede Probe gefärbt wurde. Bei der Kontrolle von Einzelflecken sollten alle Kanäle mit ausgeschaltetem Hellfeld und Seitenstreuung ausgewählt werden. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Aufnehmen" unter dem Feld "Erfassung"; Wenn die Anzahl der Ereignisse den angegebenen Schwellenwert erreicht, wird die Erfassung automatisch gestoppt.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche "Zurück", um das Rohr zu entladen. Die Schritte 7.2.4 - 7.2.6 für jede Einzelfleckenkontrolle wiederholen. Je nach Zytometer und Software ist es möglicherweise nicht möglich, alle in Abbildung 1 gezeigten Gates während der Aufnahme einzustellen (ein genaueres Gating wird während der Analyse durchgeführt; siehe Abschnitt 8).
- Erfassen Sie Proben wie bei einfach gefärbten Proben (in Schritt 7.2), aber wählen Sie im Feld "Kanäle" alle Kanäle aus, die benötigt werden, einschließlich des Hellfeldkanals.
- Vergewissern Sie sich vor der Datenaufzeichnung, dass die Kanalintensität für die Identifizierung der gewünschten Zellpopulationen geeignet ist. Wenn nicht, passen Sie die Lasereinstellungen an und zeichnen Sie die Kontrollen für einzelne Flecken mit den neuen Einstellungen erneut auf, wie in Schritt 7.2 beschrieben.
- Erfassen Sie für jede Stichprobe mehrere Zehntausend Ereignisse.
Anmerkung: Unter den meisten Bedingungen machen Zell-Zell-Kontaktereignisse eine kleine Minderheit der Gesamtzellzahl aus (die meisten sind einzelne Zellen). Im Allgemeinen ist es wünschenswert, mindestens 100 Ereignisse im endgültigen Membrankontakttor zu haben.
