Identifizierung und Zählung von Immunzellen in bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit mittels Durchflusszytometrie

Zusammenfassung

Quelle: Van Hoecke, L. et al., Bronchoalveoläre Lavage der Lunge von Mäusen zur Analyse der Infiltration von Entzündungszellen.J. Vis. Exp.(2017)

Dieses Video zeigt die Verwendung der Durchflusszytometrie zur Identifizierung und Zählung verschiedener Immunzellen in bronchoalveolärer Lavage-Flüssigkeit. Zunächst werden einzelne Immunzellen mit einem Viabilitätsfarbstoff identifiziert, gefolgt von einer differentiellen Färbung von Oberflächenmarkerproteinen, die eine genaue Zählung der einzelnen Zelltypen ermöglicht.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Vorbereitung

1. Lavage-Flüssigkeit
   1. Bereiten Sie eine ausgewogene Salzlösung mit 100 μM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) vor.
      Anmerkung: Zur Messung des Proteingehalts in der bronchoalveolären Lavage (BAL)-Flüssigkeit wird empfohlen, Proteaseinhibitoren hinzuzufügen, um die Proteaseaktivität in der BAL-Flüssigkeit zu verhindern.
2. Katheter
   1. Stellen Sie einen Katheter her, indem Sie eine 23-G-Nadel in ei....

Ergebnisse

Abbildung 1: Gating-Strategie für den durchflusszytometrischen Nachweis von Makrophagen, dendritischen Zellen, T-Zellen, B-Zellen, Neutrophilen und Eosinophilen in BAL-Flüssigkeit. Die BAL-Zellen wurden unter Verwendung des beschriebenen BAL-Protokolls isoliert. Die Zellen wurden 24 Stunden nach intratrachealer Instillation von Lipopolysaccharid aus Mäusen isoliert. Zählkügelchen und Zellen wurden.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Ausgewogene Salzlösung	Thermo Fisher Scientific	Nr. 14175-129
Ethyleendiamintetraessigsäure	Sigma-Aldrich	Nr. E6511	ärgerlich
23G x 1 1/4 Nadel	Henke Sass Wolf	4710006030	Größe: 0,60 x 30 mm
26G x 1/2 Zoll	Henke Sass Wolf	4710004512	Größe: 0,45*12 mm
Kunststoff-Schläuche	BD Medizintechnik	427411	Polyethylen-Schlauch, Innendurchmesser 0,58 mm (.023") Außendurchmesser . 965 mm (0,38 Zoll) 30,5 m (100')
Natrium-Pentobarbital	Kela NV	514
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Lonza	BE17-516F	PBS ohne Ca++, Mg++ oder Phenolrot; steril filtriert
1 ml Spritzen	Henke Sass Wolf	5010.200V0	nicht pyrogen und ungiftig
Zange	Fine Science Tools GmbH	Artikel-Nr.: 91197-00
Chirurgische Schere	Fine Science Tools GmbH	Artikel-Nr.: 91460-11
Zentrifugenröhrchen 50 ml	heit. Geyer	7696705	Frei von Rnase/Dnase/Endotoxin
Zentrifugenröhrchen 15 ml	heit. Geyer	7696702	Frei von Rnase/Dnase/Endotoxin
Mikrozentrifugenröhrchen 1,5 ml	Sigma-Aldrich	Tel.: 0030 120.094	Polypropylen
Mikrozentrifuge	Sigma-Aldrich	5415R
Zentrifuge	Thermo Fisher Scientific	75004030
Ammoniumchlorid-Kalium (ACK) Lysingpuffer	Lonza	10-548E	Steril gefiltert
Lebend/tot -efluor506	Ebiowissenschaften	Tel.: 65-0866-18	Fixierbarer Viabilitätsfarbstoff
CD11c-PE-cy7	eBiowissenschaften	Artikel-Nr.: 25-0114-81
SiglecF-PE	BD Pharmingen	552126
MHCII-APCefluor780	Biolegende	107628
CD3-PE-cy5	VWR	Artikel-Nr.: 55-0031-U100
CD19-PE-cy5	eBiowissenschaften	Artikel-Nr.: 15-0193-83
CD11B-V450	BD Pharmingen	560455
Ly6G-AF700	Biolegende	127621
Absolute Zählperlen	Life Technologies Europe B.V.	Nr. C36950
Anti-CD16/CD32	BD Pharmingen	553142
96-Well-Speicherplatte mit 340 μl	Falke	353263	V-Boden, natürliches Polypropylen
Durchflusszytometer	BD Biowissenschaften
Katheter	BD Biowissenschaften	393202