Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Vorbereitung
- Lavage-Flüssigkeit
- Bereiten Sie eine ausgewogene Salzlösung mit 100 μM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) vor.
Anmerkung: Zur Messung des Proteingehalts in der bronchoalveolären Lavage (BAL)-Flüssigkeit wird empfohlen, Proteaseinhibitoren hinzuzufügen, um die Proteaseaktivität in der BAL-Flüssigkeit zu verhindern.
- Katheter
- Stellen Sie einen Katheter her, indem Sie eine 23-G-Nadel in einen 21-G-Schlauch aus transparentem Kunststoff aus Polyethylen einführen (Innendurchmesser: 0,58 mm, Außendurchmesser: 0,965 mm und Länge: 0,5 cm). Es können auch vorgefertigte Katheter verwendet werden.
- anästhetika
- Bereiten Sie ein terminales Anästhetikum vor, vorzugsweise eines, das einen Atemstillstand verursacht (z. B. ein Barbiturat wie Natrium-Pentobarbital (>100 mg/kg) Lösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS)).
Anmerkung: Es wird empfohlen, eine injizierte Anästhesie anstelle einer Inhalationsanästhesie zu verwenden, da eine Inhalationsanästhesie den BAL-Flüssigkeitsgehalt beeinflussen kann. CO2 hat beispielsweise Einfluss auf den pH-Wert des Blutes und damit auf die Umverteilung verschiedener Verbindungen.
- Ammoniumchlorid-Kalium (ACK) Puffer zur Lyse roter Blutkörperchen
- Bereiten Sie einen ACK-Lysepuffer vor, indem Sie 8,29 g Ammoniumchlorid (NH4Cl) und 1 g Kaliumbicarbonat (KHCO3) in 1 l H2O mit 100 μM EDTA lösen. Lysepuffer für rote Blutkörperchen kann auch von einer externen Quelle erworben werden.
>2. Durchführung der bronchoalveolären Lavage (BAL)
- Einführung des Katheters in die Luftröhre
- Die Maus wird durch intraperitoneale Injektion einer tödlichen Dosis eines kurzwirksamen Barbiturat-Anästhetikums mit einer 26-G-Nadel eingeschläfert. Um die richtige tödliche Anästhesie zu bestätigen, kneifen Sie die hintere Pfote der Maus mit einer Zange zusammen, um den Fußreflex zu überprüfen.
- Legen Sie das Tier auf den Rücken auf eine chirurgische Platte und fixieren Sie die Maus, indem Sie die Gliedmaßen festnageln.
- Sprühen Sie zur Desinfektion 70% Ethanol auf den Hals. Machen Sie mit einem Skalpell einen Schnitt in die Halshaut in der Nähe der Luftröhre.
- Öffnen Sie die Haut, um die Speicheldrüsen freizulegen. Trennen Sie die Speicheldrüsen, indem Sie den Sternohyoideus-Muskel mit einer Zange freilegen. Schneiden Sie den Muskel um die Luftröhre herum mit einer Zange ein, um die Luftröhre freizulegen.
- Legen Sie mit einer Zange einen Baumwollfaden unter die Luftröhre.
- Stechen Sie vorsichtig mit einer 26 G Nadel in die Mitte der freiliegenden Luftröhre zwischen zwei Knorpelringen. Achten Sie darauf, die Luftröhre nicht weiter zu beschädigen.
- Führen Sie den Katheter etwa 0,5 cm in die Luftröhre ein. Achten Sie darauf, dass der Katheter nicht zu weit in die Luftröhre eingeführt wird, da dies zu einer Schädigung der Lungenstruktur führen kann.
- Stabilisieren Sie den Katheter, indem Sie die Luftröhre mit dem in Schritt 2.1.5 platzierten Baumwollfaden um den Katheter binden. Wenn der Katheter nicht ausreichend gebunden ist, kann die injizierte ausgewogene Salzlösung in den oberen Teil der Atemwege fließen, anstatt in die Lunge.
- Sammeln Sie die Spülflüssigkeit
- Laden Sie eine 1-ml-Spritze mit 1 mL steriler, ausgewogener Salzlösung mit 100 μM EDTA.
- Verbinden Sie die 1-ml-Spritze mit dem Katheter und injizieren Sie das Salz/EDTA-Lösung vorsichtig in die Lunge.
- Saugen Sie die Lösung vorsichtig ab, während Sie den Thorax der Maus massieren. Wenn die Aspiratflüssigkeit in der Spritze nicht sichtbar ist, führen Sie den Katheter vorsichtig etwas weiter unten oder oben in der Luftröhre ein.
- Entfernen Sie die Spritze von der Nadel und geben Sie die zurückgewonnene Spülflüssigkeit in ein 15-ml-Röhrchen, das auf Eis gestellt wird. Normalerweise werden 700 - 900 μl BAL aus 1 ml injizierter Lösung zurückgewonnen.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.2.1 - 2.2.4 noch zweimal.
Anmerkung: Wenn der Zweck darin besteht, den nicht-zellulären Inhalt zu analysieren, wird empfohlen, die gepoolten Proben zu konzentrieren, wenn Empfindlichkeitsprobleme auftreten.
>3. Sammeln der zellulären und nicht-zellulären Bestandteile der BAL-Flüssigkeit
- Die Spülflüssigkeit wird 7 min lang bei 400 x g und 4 °C zentrifugiert.
- Sammeln Sie den Überstand und verwenden Sie ihn sofort für weitere Analysen (z. B. Enzyme-linked Immunosorbent Assay, ELISA) oder frieren Sie ihn bei -80 °C ein. Bewahren Sie das Zellpellet auf, um den zellulären Einstrom in die Lunge zu analysieren.
- Das Zellpellet wird in 200 μl ACK-Lysingpuffer resuspendiert.
Anmerkung: Dieser Schritt gewährleistet die Lyse der Erythrozyten, während die weißen Blutkörperchen intakt bleiben.
- 2 min bei RT inkubieren.
Anmerkung: Um die durch die Lyse der roten Blutkörperchen verursachte Variation zu reduzieren, sollte dieser Schritt nicht länger als 2 Minuten durchgeführt werden.
- Fügen Sie 1 ml kaltes PBS hinzu, um den ACK-Lysingpuffer zu verdünnen.
- 7 Minuten lang bei 400 x g und 4 ΰC zentrifugieren. Der Überstand wird verworfen und die Zellen werden in einem ausreichenden Volumen PBS für die nachgelagerte Analyse wieder suspendiert (siehe unten).
Anmerkung: Das Volumen des PBS hängt von der nachgelagerten Studie ab, die durchgeführt wird.
>4. Analyse der verschiedenen Zelltypen in der BAL-Flüssigkeit mittels Durchflusszytometrie
HINWEIS: Eine Möglichkeit besteht darin, die absolute und relative zelluläre Zusammensetzung der BAL-Flüssigkeit durch Durchflusszytometrie zu analysieren. Das Ziel dieser Arbeit ist es, die Technik der BAL näher zu erläutern. Die Durchflusszytometrie ist eine eigenständige Spezialtechnik. Es wird empfohlen, Fachartikel über die Durchflusszytometrie-Technik zu lesen. Es werden Antikörper verwendet, die an ein Fluorophor gekoppelt sind und Oberflächenantigene (siehe Tabelle 1) erkennen, die für einen bestimmten Zelltyp(en) spezifisch sind. Durch die Verwendung einer Gating-Strategie ist es möglich, T-Zellen, Makrophagen, dendritische Zellen, B-Zellen, Eosinophile und Neutrophile in der Zellfraktion des BAL zu identifizieren.
- Färbung der Zelloberfläche
Anmerkung: Es ist wichtig, alle kritischen Kontrollen für die Durchflusszytometrie-Analyse einzubeziehen. Es werden drei Sätze von Röhrchen benötigt (siehe Tabelle 2): (1) Röhrchen mit den Proben; (2) Röhrchen mit BAL-Zellen für jeden Antikörper-Fluorophor zur Herstellung einzelner Färbungen; Dies ermöglicht die Bestimmung der Spannungen für jeden Kanal am Durchflusszytometer; und (3) Röhrchen mit Kügelchen für jeden Antikörper-Fluorophor, um Einzelfärbungen herzustellen; Dies dient dazu, die Vergütungsmatrix zu bestimmen.
- Nehmen Sie eine Mischung aus den Antikörpern und dem Fc-Block (Anti-CD16/CD32) in PBS in den entsprechenden Verdünnungen vor (siehe Tabelle 2). Es ist notwendig, die optimale Arbeitsverdünnung für jeden Antikörper vor dem Experiment zu bestimmen.
- Resuspendieren Sie die Zellen in 50 μl des Antikörpermixes für die Probe und geben Sie 50 μl des entsprechend verdünnten Antikörpers in die kritischen Kontrollen.
Anmerkung: Die Färbung kann in einer U-förmigen 96-Well-Platte durchgeführt werden. Dadurch ist es möglich, das Fleckenvolumen einfach zu reduzieren und große Mengen an Proben zu verarbeiten.
- 30 min im Dunkeln bei 4 °C inkubieren.
- 7 min bei 400 x g und 4 ΰC zentrifugieren. Den Überstand verwerfen.
- Resuspendieren Sie die Zellen in PBS auf ein Endvolumen von 200 μl.
Anmerkung: Dieses endgültige Volumen hängt von dem minimalen Volumen ab, auf das das Durchflusszytometer zugreifen kann. Dies kann je nach Maschine leicht unterschiedlich sein. Darüber hinaus hängt das Lesevolumen von der Anzahl der Zellen und/oder der Zeit ab, die die Probe benötigt, um im Durchflusszytometer zu laufen.
- Verwenden Sie die Proben und Kontrollen für die durchflusszytometrische Analyse.
Anmerkung: Um die absolute Zellzahl der verschiedenen Zellpopulationen zu bestimmen, sollten Zählperlen hinzugefügt werden. Geben Sie die gleiche Anzahl von Kügelchen (± 25.000 Kügelchen) zu jeder Probe kurz vor der Messung. Durch die Verwendung von Vorwärts- und Seitenstreuung können Zählbeads durchflusszytometrisch identifiziert werden (siehe Abbildung 1). Anschließend kann die absolute Anzahl der Zellen in der Probe berechnet werden, indem das Verhältnis von Bead-Ereignissen zu Zellereignissen verglichen wird. Die folgende Formel kann verwendet werden:
- Durchflusszytometrische Analyse
Anmerkung: Die durchflusszytometrische Analyse sollte unmittelbar nach Abschluss des Färbeprotokolls durchgeführt werden. Es muss ein Durchflusszytometer mit entsprechenden Lasern und Filtern zur Signaldetektion verwendet werden. Tabelle 3 gibt einen Überblick über die Laser und Filter, die für die in diesem Manuskript beschriebene Studie benötigt werden. Weitere Informationen zur durchflusszytometrischen Analyse finden Sie unter Adan et al..
- Richten Sie die primären Tore basierend auf der vorderen und seitlichen Streuung ein, ohne Schmutz und Dubletten (siehe Abbildung 1).
- Passen Sie die Spannung und die Kompensation der spektralen Überlappung mit Hilfe der einfach gefärbten Küvetten und Beads an.
Anmerkung: Diese Einstellungen sind für jedes Durchflusszytometer unterschiedlich und müssen vor jedem Experiment überprüft werden. Für eine korrekte Strömungsanalyse sind die Vorwärts- und Seitenstreuspannungen entscheidend. Eine korrekte Vorwärts- und Seitenstreuung kann bei der Identifizierung und Bestätigung der Identität der analysierten Zellen helfen. Um diese Spannungen zu bestimmen, sollte zuerst eine ungefärbte Probe entnommen werden.
- Richten Sie Fluoreszenz-Gates für das Oberflächenantigen ein (siehe Abbildung 1) und analysieren Sie die Proben.
Tabelle 1: Auswahl von Oberflächenantigenen von Immunzellen. Diese Tabelle enthält eine Liste von Oberflächenepitopen, die zur Charakterisierung der verschiedenen Zelltypen verwendet werden. Kombinationen aus mehreren Markern sind erforderlich, um einen bestimmten Zelltyp zuverlässig zu definieren.
| Antigen | Zellentyp |
| Cluster der Differenzierung 3 (CD3) | Wird auf T-Zellen exprimiert |
| Cluster der Differenzierung 11c (CD11c) | Hohe Expression auf den meisten dendritischen Zellen, aber auch auf Monozyten, Makrophagen, Neutrophilen und einigen B-Zellen. |
| Cluster der Differenzierung 11b (CD11b) | Exprimiert auf der Oberfläche vieler Leukozyten, einschließlich Monozyten, Neutrophilen, natürlichen Killerzellen, Granulozyten und Makrophagen. |
| SiglecF | Alveolarmakrophagen und Eosinophile. |
| MHCII | Normalerweise nur auf antigenpräsentierenden Zellen wie dendritischen Zellen, mononukleären Phagozyten und B-Zellen zu finden. |
| CD19 | B-Lymphozyten-Antigen |
| Ly-6G | Ein Marker für Monozyten, Granulozyten und Neutrophile |
Tabelle 2. Liste der einzuschließenden Steuerelemente. Diese Tabelle zeigt alle notwendigen Kontrollen für die genaue Interpretation der erhaltenen Ergebnisse.
kg
kg
kg
kg
kg
kg
kg
kg
kg
kg
kg
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kg
kg
kg
kg
kg
kg
kg
kg
kg
kg
kg
kg
kg
| proben | | | | |
| Rohr | Antigen-Fluorophor zur Zugabe zu Zellen | Konzentration des Antikörperstamms (mg/ml) | Antikörper-Verdünnung | Gesamtvolumen (μL) |
| Fixierbarer Viabilitätsfarbstoff | 0,2 | 1/1000 | Nr. 50 |
| CD11c | 0,2 | Nr. 1/800 | Nr. 50 |
| SiglecF | 0,2 | 1/100 | Nr. 50 |
| Beispiel X | MHCII | 0,2 | Nr. 1/200 | Nr. 50 |
| CD3 | 0,2 | Nr. 1/200 | Nr. 50 |
| CD19 | 0,2 | Nr. 1/200 | Nr. 50 |
| CD11b | 0,2 | Nr. 1/200 | Nr. 50 |
| Ly6G | 0,2 | Nr. 1/200 | Nr. 50 |
| Spannungsregler | | | | |
| Rohr | Antigen-Fluorophor zur Zugabe zu Zellen | Konzentration des Antikörperstamms (mg/ml) | Antikörper-Verdünnung | Gesamtvolumen (μL) |
| Ungefärbte Zellen | / | / | / | Nr. 50 |
| Einzeln gefärbte Zellen | Fixierbarer Viabilitätsfarbstoff | 0,2 | 1/1000 | Nr. 50 |
| Einzeln gefärbte Zellen | CD11c | 0,2 | Nr. 1/800 | Nr. 50 |
| Einzeln gefärbte Zellen | SiglecF | 0,2 | 1/100 | Nr. 50 |
| Einzeln gefärbte Zellen | MHCII | 0,2 | Nr. 1/200 | Nr. 50 |
| Einzeln gefärbte Zellen | CD3 | 0,2 | Nr. 1/200 | Nr. 50 |
| Einzeln gefärbte Zellen | CD19 | 0,2 | Nr. 1/200 | Nr. 50 |
| Einzeln gefärbte Zellen | CD11b | 0,2 | Nr. 1/200 | Nr. 50 |
| Einzeln gefärbte Zellen | Ly6G | 0,2 | Nr. 1/200 | Nr. 50 |
| Kompensations-Kontrollen | | | | |
| Rohr | Antigen-Fluorophor zur Zugabe zu Kügelchen | Konzentration des Antikörperstamms (mg/ml) | Antikörper-Verdünnung | Gesamtvolumen (μL) |
| Ungefärbte Perlen | / | / | / | 200 |
| Einfach gefärbte Perlen | CD11c | 0,2 | Nr. 1/2000 | 200 |
| Einfach gefärbte Perlen | SiglecF | 0,2 | Nr. 1/2000 | 200 |
| Einfach gefärbte Perlen | MHCII | 0,2 | Nr. 1/200 | 200 |
| Einfach gefärbte Perlen | CD3 | 0,2 | Nr. 1/2000 | 200 |
| Einfach gefärbte Perlen | CD19 | 0,2 | Nr. 1/2000 | 200 |
| Einfach gefärbte Perlen | CD11b | 0,2 | Nr. 1/400 | 200 |
| Einfach gefärbte Perlen | Ly6G | 0,2 | Nr. 1/200 | 200 |
Tabelle 3: Überblick über die Laser und Filter des Durchflusszytometers, die in dieser Studie verwendet wurden.
kg
kg
| Lasertyp | Filter einrichten | |
| 505 LP | 525/50 |
| Blau (488 nm) | 550 LP | Nr. 575/26 |
| 100 mW | 670 LP | Nr. 685/35 |
| 750 LP | 780/60 |
| violett 405 nm | | 450/50 |
| 100 mW | | |
| rot 633 nm | | Nr. 660/20 |
| 70 mW | 750 LP | 780/60 |
