>1. Einrichten von replizierenden und nicht replizierenden MIC90-Assays
- Inokulieren Sie M. tuberculosis, M. bovis BCG oder M. smegmatis mit einem OD580 von 0,01-0,1 und expandieren Sie bis zur mittleren logarithmischen Phase (OD580 ~ 0,5) in Middlebrook 7H9-ADN (Middlebrook 7H9 enthält 0,2 % Glycerin, 0,2 % Dextrose, 0,5 % Albumin und 0,085 % NaCl) oder 7H9-OADC (Middlebrook 7H9 enthält 0,2 % Glycerin und 10 % OADC-Supplement).
- Züchten Sie M. tuberculosis und M. bovis BCG als ~20 ml stehende Kulturen in Zellkulturflaschen und M. smegmatis durch Schütteln in Polypropylen-Rundboden- (4 ml Kultur) oder 50 ml konischen Zentrifugenröhrchen (10-20 ml Kultur). Inkubieren Sie pathogene Mykobakterien bei 37 °C mit 20 %O2 und 5 % CO2 und M. smegmatis bei 37 °C mit 20 %O2.
- Richten Sie ein Experiment im MIC90-Stil (Minimal-Inhibitory Concentration) unter replizierenden und nicht-replizierenden Bedingungen ein (Abbildung 1).
Anmerkung: Testmittel werden in der Regel in Duplikaten oder Vierfachpräparaten getestet, um die Prüfung von 4 bzw. 2 Verbindungen pro 96-Well-Mikroplatte zu ermöglichen. In einer 96-Well-Platte kann beispielsweise ein Testmittel in den Reihen A-D und ein anderer in den Reihen E-H getestet werden. Das DMSO (Vehikel) befindet sich in den Spalten 1, 2 und 12, und die Verdünnungsreihe des Prüfmittels verläuft von Spalte 3 (niedrigste Konzentration) bis Spalte 11 (höchste Konzentration). Assays im MIC90-Stil verwenden typischerweise eine 2-fache Verdünnungsreihe. Es gibt zahlreiche nicht-replizierende Modelle für Mykobakterien, und zur Veranschaulichung verwenden wir ein Multi-Stress-Modell der Nicht-Replikation.
- Für den replizierenden Assay werden 200 μl Zellen in 7H9-ADN mit einem OD580 von 0,01 in alle Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit klarem Boden verteilt, die mit Gewebekulturen behandelt wurde.
- Für den nicht-replizierenden Assay werden die Zellen zweimal in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit 0,02 % Tyloxapol gewaschen und in nicht-replizierendem Medium resuspendiert (0,05 % KH2PO4, 0,05 % MgSO4, 0,005 % Eisenammoniumcitrat, 0,0001 % ZnCl2, 0,1 % NH4Cl, 0,5 % BSA, 0,085 % NaCl, 0,02 % Tyloxapol, 0,05 % Butyrat; pH-Wert angepasst auf 5,0 mit 2 N NaOH).
- Die Zellen werden in einem nicht replizierenden Medium auf einen OD580 von 0,1 verdünnt und NaNO2 aus einem frisch vorbereiteten 1 M Stamm bis zu einer Endkonzentration von 0,5 mM zugegeben.
- Verteilen Sie 200 μl Zellen mit einem OD580 von 0,1 in alle Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit klarem Boden, die mit Gewebekulturen behandelt wurde.
Anmerkung: Bereiten Sie die Verdünnungen der Verbindung als 100-fache Stammlösungen in DMSO vor. Daher würde eine typische MHK-Platte, die die Auswirkungen eines Moleküls bei einer Endkonzentration von 0,4-100 μg/ml testet, Stammlösungen von 0,04-10 mg/ml in DMSO erfordern.
- 2 μl Verdünnungen des Prüfmittels 1 werden in die Reihen A-E und 2 μl Verdünnungen des Prüfmittels 2 in die Reihen E-H gegeben. Gründlich mischen.
- Geben Sie 2 μl Vehikelkontrolle (in der Regel DMSO) in die Kontrollvertiefungen, Spalten 1, 2, 12 (Zeilen A-H). Gründlich mischen.
- Für jedes Experiment ist mindestens eine Positivkontrolle wie Rifampicin von 0,004 bis 1 μg/ml (replizierender Assay) und/oder 0,08 bis 20 μg/ml (nicht replizierender Assay) einzuschließen.
Anmerkung: Die Verwendung von 6-Brom-1H-indazol-3-amin9 in einer Menge von 0,1 bis 25 μg/ml wird als Kontrollverbindung empfohlen, die im Multistress-Modell der Nicht-Replikation eine selektive, NaNO2-abhängige Aktivität aufweist.
- Für die Replikation von Assays inkubieren Sie Mikrotiterplatten bei 37 °C bei 20 %O 2 und 5 % CO2 für 7 Tage (M. tuberculosis und M. bovis BCG) oder 1-48 Stunden (M. smegmatis). Für das Multi-Stress-Modell der Nicht-Replikation inkubieren Sie Mikrotiterplatten 7 Tage lang bei 37 °C bei 1 % O2 und 5 % CO2 (M. tuberculosis und M. bovis BCG).
>2. Beimpfung von CARA-Mikroplatten
- Zu Zeitpunkten, zu denen das CARA als Ausleseeinheit verwendet wird, resuspendieren Sie den Well-Inhalt der MIC90-Assay-Platte vorsichtig mit einer p200-Mehrkanalpipette, die auf 50-75 μl eingestellt ist. Pipettieren Sie mindestens 5-10 Mal auf und ab und schwenken Sie den Well-Inhalt vorsichtig in kreisenden Bewegungen mit den Pipettenspitzen.
- Übertragen Sie 10 μl des Assay-Well-Inhalts auf die CARA-Mikroplatte. Stellen Sie sicher, dass die Reihenfolge des Well-Inhalts auf der Assay-Platte mit der Reihenfolge des Well-Inhalts der CARA-Mikroplatte übereinstimmt. Vermeiden Sie Spritzer während der Transfers und stellen Sie sicher, dass die 10 μl in der Mitte der CARA-Mikrotiterplatten-Vertiefungen platziert werden. Vergewissern Sie sich, dass die 10 μl in die CARA-Mikroplatte aufgenommen werden.
Anmerkung: Es sind keine Verdünnungen erforderlich, bevor Zellen auf den CARA-Mikrotiterplatten aufgespürt werden.
- Binden Sie Stapel von CARA-Mikrotiterplatten mit Plattenband und legen Sie sie dann in einen wiederverschließbaren Plastikbeutel. CARA-Mikrotiterplatten bei 37 °C mit 20 % O2 (M. smegmatis) oder 1 % O2 und 5 % CO2 (M. tuberculosis und M. bovis BCG) inkubieren.
- Für M. tuberculosis und M. bovis BCG, replizierende Assays: 7 Tage inkubieren; für M. tuberculosis und M. bovis BCG nicht-replizierende Assays, 10 Tage inkubieren; für M. smegmatis, replizierende Assays, 1-2 Tage inkubieren; für M. smegmatis, nicht replizierende Assays, 2-3 Tage inkubieren.
HINWEIS: Die Zeiten sind Schätzungen und können für verschiedene replizierende, nicht replizierende und Stressbedingungen entsprechend geändert werden.
>3. Entwicklung von CARA-Mikroplatten
- Entwickeln Sie die CARA-Mikroplatten, wenn ein Film aus Bakterienwachstum oder größere, makroskopische Kolonien auf den negativen (Vehikel-)Kontrollvertiefungen sichtbar sind.
Anmerkung: Nach längerer Inkubation erscheinen CARA-Mikrotiterplatten-Wells oft trocken und wir empfehlen, den Inhalt der Wells mit sterilem PBS vorzubenetzen. Dies dient dazu, zu verhindern, dass die Holzkohle Resazurin absorbiert, was zu einer geringen Fluoreszenz oder Well-zu-Well-Schwankungen führen kann.
- Geben Sie mit einem einzigen Satz von 12 p200-Spitzen und einer Mehrkanalpipette 40 μl steriles PBS entlang der Seite der Wells ab und lassen Sie das PBS über die Oberseite der Agar-/Bakterien-Mikrokolonien verteilen.
- Bereiten Sie das CARA-Entwicklungsreagenz vor, indem Sie 5 mg Resazurin (0,01 % endgültig) und 50 ml 5 % Tween-80 in PBS mischen. Vortex- und Sterilfilter.
Anmerkung: Ein alternatives CARA-Entwicklungsreagenz kann durch Mischen einer kommerziell hergestellten Resazurin-Flüssiglösung im Verhältnis 1:1 (vol/vol) mit 10 % Tween80 in PBS hergestellt werden.
- Geben Sie 50 μl frisch zubereitetes CARA-Entwicklungsreagenz mit einer 12-Kanal-Pipette in jede Vertiefung der CARA-Mikroplatte. Schütteln Sie die Platten einige Male hin und her, um die Reagenzien über den Agar und die Bakterienmatte in jeder Vertiefung zu verteilen.
- Legen Sie die Platten in einen wiederverschließbaren Plastikbeutel und inkubieren Sie sie bei 37 °C für mindestens 30 min für M. smegmatis und 45-60 min für M. tuberculosis oder M. bovis BCG.
Anmerkung: Wenn sich die Kontrollvertiefungen des Fahrzeugs innerhalb der ersten Stunde nicht rosa färben, können die Platten erneut verpackt und für längere Zeit inkubiert werden.
- Legen Sie die CARA-Mikrotiterplatten vor der Fluoreszenzmessung 15 Minuten lang bei Raumtemperatur in eine Biosicherheitshaube, wobei die Deckel entfernt wurden. Wenn Sie BSL3-Spektralphotometer außerhalb einer Biosicherheitswerkbank verwenden, kleben Sie einen PCR-Aufkleber in optischer Qualität auf die Platte und verschließen Sie ihn fest, indem Sie mit einem weichen Papiertuch vorsichtig auf die Aufkleberoberfläche drücken.
- Bestimmung der Fluoreszenz über Top Read mit Anregung bei 530 nm und Emission bei 590 nm. Es ist nicht notwendig, die Platte zu leeren.
