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Methodenartikel

Ein Assay für die TLR-abhängige NF-кB/AP-1-Transkriptionsfaktor-Signalgebung in Makrophagen

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8. Juli 2025

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Quelle: McKiel, L. A., et al. Ein Makrophagen-Reporterzell-Assay zur Untersuchung der Toll-like-Rezeptor-vermittelten NF-kB/AP-1-Signalübertragung auf adsorbierten Proteinschichten auf polymeren Oberflächen. J. Vis. Exp. (2020).

Dieses Video zeigt einen Assay zur Untersuchung der Toll-like Rezeptor (TLR)-abhängigen Aktivität der Transkriptionsfaktoren Kernfaktor-kappa-B (NF-κB) und Aktivatorprotein-1 (AP-1) in Makrophagen. Die TLRs lösen bei der Erkennung von schadensassoziierten molekularen Mustern (DAMPs) eine proinflammatorische Signalkaskade aus, die NF-κB und AP-1 aktiviert. Die manipulierten Reportermakrophagen produzieren bei Aktivierung von NF-κB und AP-1 ein sezerniertes embryonales alkalisches Phosphatase-Enzym (SEAP), das über eine chromogene Reaktion nachgewiesen wird.

Protokoll

>1. Medien- und Reagenzienvorbereitung

  1. Bereiten Sie das Fibroblastenmedium vor. Kombinieren Sie 450 ml Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM), 50 ml fötales Rinderserum (FBS) und 5 ml Penicillin/Streptomycin. Bei 4 °C bis zu 3 Monate lagern.
  2. Bereiten Sie Reporter-Makrophagen-Wachstumsmedien in 50-ml-Aliquoten vor. Kombinieren Sie 45 mL DMEM, 5 mL FBS, 5 μg/ml Mykoplasmen-Eliminierungsreagenz (Materialtabelle) und 200 μg/ml Phleomycin D1 (Materialtabelle). Bei 4 °C bis zu 3 Monate lagern.
  3. Bereiten Sie Reporter-Makrophagen-Assaymedien in 50-ml-Aliquoten vor. Kombinieren Sie 45 ml DMEM....

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Ergebnisse

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Abbildung 1: Methoden und Ergebnisse für den alkalischen Phosphatase-Assay von NF-кB/AP-1-Reportermakrophagen auf TCPS, PMMA, PDMS und fPTFE. (A) Diagramm des Arbeitsablaufs für den Reporter-Makrophagen-Alkali-Phosphatase-Assay. (B) Western-Blot von Lysat, der das Vorhandensein der DAMP-Spezies HMGB1 und HSP60 bestätigt, mit β-Aktin als Belastungskontrolle. (

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Offenlegungen

Es wurden keine Interessenkonflikte angegeben.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Reagenzien für Zellkulturen
Anti-Maus/humanes CD282 (TLR2)Biolegende121802
CLI-095 (TLR4-Inhibitor)InvivogenTLRL-CLI95
C57 Komplementplasma K2 EDTA 10ml, innovative Qualität US-HerkunftInnovativeForschungIGMSC57-K2 EDTA-Compl-10mlPlasma der Maus
Dulbeccos modifiziertes Eagle Medium (DMEM)Sigma AldrichD6429-500ML
Dulbecco-Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (DPBS)Fisher Scientific14190250Kein Kalzium, kein Magnesium
Fötales Rinderserum (FBS), ForschungsqualitätWisentArtikel-Nr.: 98150
LPS-EKInvivogenTLRL-EKLPSLipopolysaccharid aus Escherichia coli K12
NIH/3T3-FibroblastenATCCCRL-1658
PAM3CSK4Invivogentlrl-pmsSynthetisches triacyliertes Lipopeptid - TLR1/2-Ligand
Penicillin/StreptomycinSigma AldrichNr. P4333-100ML
PlastocinInvivogenANT-MPPReagenz zur Eliminierung von Mykoplasmen
RAW-Blue-ZellenInvivogenraw-spNF-κB/AP-1 Reporter-Makrophagen-Zelllinie
Trypanblau-Lösung, 0,4 %Fisher Scientific15250061
TrypLE-Express-Enzym (1X)Fisher Scientific12604021Rekombinantes Zelldissoziationsenzym ohne tierischen Ursprung
ZeocinInvivogenANT-ZN-1
Kits und Assays
ELISA vorbeschichtete Platten, Maus IL-6BiolegendeB213022
ELISA vorbeschichtete Platten, Maus TNF-αBiolegendeB220233
Endotoxin (Escherichia coli) - Kontrolle von Standard-Endotoxin (CSE)Gesellschafter von Cape Cope Inc.Nr. E0005-5Endotoxin für die Standardkurve im chromogenen Endotoxin-Assay
LAL Wasser, 100 mLGesellschafter von Cape Cope Inc.Artikelmappe 1001Wird mit chromogenem Endotoxin-Assay verwendet
Mikro-BCA-Protein-AssayFisher ScientificPI23235
Limulus Amöbozytenlysat (LAL) Pyrochrom-Endotoxin-TestkitGesellschafter von Cape Cope Inc.Nr. C1500-5Chromogenes Endotoxin-Assay-Reagenz
QUANTI-Blue Detektionsmedium für alkalische PhosphataseInvivogenrep-qb2Alkalischer Phosphatase-Assay zur indirekten Messung der NF-κB/AP-1-Aktivität
Reagenzien für polymere Beschichtungen
Chloroform, wasserfreiSigma Aldrich288306-1L
Ethylalkohol wasserfreiKommerzielle AlkoholeP006EAANSigma: Reagenz Alkohol, wasserfrei, 676829-1L
Gerade konische Pinzette mit feiner SpitzeFisher ScientificTel.: 16-100-113
Fluorinertes FC-40-LösungsmittelSigma AldrichNr. F9755-100MLFluoriertes Lösungsmittel für fPTFE
Wasser in Zellkulturqualität (endotoxinfrei)Fisher ScientificSH30529LS
Poly(methylmethacrylat) (PMMA)Sigma Aldrich182230-25G
Sylgard 184 Elastomer-BausatzFisher Scientific50822180
Teflon-AF (fPTFE)Sigma AldrichArtikel-Nr.: 469610-1GPoly[4,5-difluor-2,2-bis(trifluormethyl)-1,3-dioxol-co-tetrafluorethylen]
verbrauchsartikel
Klebeplatten-DichtungenFisher ScientificAB-0580
Axygen Mikroröhrchen, 1,5 mLFisher ScientificTel.: 14-222-155
Szintillationsfläschchen aus Borosilikatglas, mit weißen Polypropylen-KappenFisher ScientificTel.: 03-337-4
Klare PS 48-Well-PlatteFisher ScientificTel.: 08-772-52
Klare TCPS 96-Well-PlatteFisher Scientific08-772-2C
Klare TCPS 48-Well-PlatteFisher Scientific08-772-1C
Deckgläser, KreiseFisher ScientificTel.: 12-545-81
Mit Falcon-Gewebekulturen behandelte Kolben, T25Fisher ScientificArtikel-Nr.: 10-126-10
sticky-Slide 8 WellEbd.Artikel-Nr.: 80828
Superfrost ObjektträgerFisher ScientificArtikel-Nr.: 12-550-15
Mit Gewebekulturen behandelte Kolben, T150Fisher ScientificTel.: 08-772-48

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