>1. Medien- und Reagenzienvorbereitung
- Bereiten Sie das Fibroblastenmedium vor. Kombinieren Sie 450 ml Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM), 50 ml fötales Rinderserum (FBS) und 5 ml Penicillin/Streptomycin. Bei 4 °C bis zu 3 Monate lagern.
- Bereiten Sie Reporter-Makrophagen-Wachstumsmedien in 50-ml-Aliquoten vor. Kombinieren Sie 45 mL DMEM, 5 mL FBS, 5 μg/ml Mykoplasmen-Eliminierungsreagenz (Materialtabelle) und 200 μg/ml Phleomycin D1 (Materialtabelle). Bei 4 °C bis zu 3 Monate lagern.
- Bereiten Sie Reporter-Makrophagen-Assaymedien in 50-ml-Aliquoten vor. Kombinieren Sie 45 ml DMEM, 5 ml hitzeinaktiviertes FBS (HI-FBS), 5 μg/ml Mykoplasmen-Eliminierungsreagenz und 200 μg/ml Phleomycin D1. Bei 4 °C bis zu 3 Monate lagern.
>2. Beschichtung von Zellkulturoberflächen mit Poly(methylmethacrylat)
- Polymethylmethacrylat (PMMA) in Chloroform bei 20 mg/ml (z. B. 100 mg PMMA in 5 ml Chloroform) in einem 20-ml-Glasszintillationsfläschchen auflösen. Legen Sie einen magnetischen Rührstab in das Fläschchen und lassen Sie ihn mindestens 2 h lang rühren, bis sich alle Feststoffe aufgelöst haben.
Vorsicht: Chloroform ist schädlich, wenn es eingeatmet wird. Stellen Sie sicher, dass Sie Lösungsmittel in einem Abzug verwenden, während Sie PVA-Handschuhe tragen.
- Pipettieren Sie 400 μl PMMA-Lösung in einem Spin-Coater auf die Mitte eines Objektträgers aus Borosilikatglas und drehen Sie sie 2 Minuten lang mit 3000 U/min. Bereiten Sie die für den Assay erforderliche Anzahl von Objektträgern sowie 3-5 zusätzliche für die Messung des Wasserkontaktwinkels vor. Bewahren Sie die Objektträger in einer sauberen Box (besprüht und mit 70 % Ethanol abgewischt) für die zukünftige Verwendung auf.
Anmerkung: Die Schleuderbeschichtung wird häufig verwendet, um eine dünne, gleichmäßige Beschichtung auf einer ebenen Oberfläche abzuscheiden. Ein Spin-Coater dreht ein Substrat mit hoher Geschwindigkeit und nutzt die Zentrifugalkraft, um die Beschichtungslösung auf der Oberfläche zu verteilen.
- Messen Sie den Wasserkontaktwinkel an zwei zufälligen Positionen auf der Oberfläche von extra beschichteten Objektträgern (d. h. nicht die Objektträger, die für die Zellkultur verwendet werden) mit einem Goniometer, um sicherzustellen, dass die Glasoberfläche vollständig mit dem Polymer beschichtet ist.
HINWEIS: Für die Messung des Wasserkontaktwinkels sollte nur Wasser mit der höchsten Reinheit (z. B. dreifach destilliertes Glas) verwendet werden.
- Befestigen Sie in einer biologischen Sicherheitswerkbank (BSC) 8-Kammer-Sticky-Wells mit einer sterilen Pinzette und nach der aseptischen Technik an PMMA-beschichteten Objektträgern. Drücken Sie fest auf die Oberseite der klebrigen Vertiefungen, um sicherzustellen, dass sie fest befestigt sind. Inkubieren Sie die Objektträger mit angebrachten klebrigen Vertiefungen über Nacht bei 37 °C, um die Versiegelung zu sichern.
- Testen Sie die Versiegelung der klebrigen Vertiefungen, indem Sie 200 μl (endotoxinfreies) Wasser in Zellkulturqualität in jede Vertiefung geben. Inkubieren Sie 60 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) und stellen Sie sicher, dass keine Leckagen auftreten, bevor Sie fortfahren. Saugen Sie das Wasser an und achten Sie darauf, die PMMA-Beschichtung nicht zu beschädigen.
- Führen Sie endotoxinfreie Wasserwäschen durch, indem Sie 300 μl endotoxinfreies Wasser in jede Vertiefung geben und vor der Verwendung 1 h (dreimal), 12 h und 24 h inkubieren, um restliches Lösungsmittel zu entfernen.
- Testen Sie die Endotoxinkonzentration der Objektträger, die für die Zellkultur verwendet werden sollen. Inkubieren Sie 200 μl endotoxinfreies Reagenzwasser (Materialtabelle) in einer Vertiefung jedes Objektträgers für 1 h. Die Endotoxinkonzentration im Extrakt wird mit einem chromogenen Endpunkt-Endotoxin-Assay gemessen (Materialtabelle).
Anmerkung: Das folgende Protokoll ist spezifisch für das in der Materialtabelle aufgeführte Endotoxin-Assay-Kit.
- Verwenden Sie für diese Arbeit nur Wasser und Verbrauchsmaterialien (z. B. Pipettenspitzen, Mikrozentrifugenröhrchen und Well-Platten), die als pyrogenfrei (d. h. endotoxinfrei) zertifiziert sind. Außerdem sollten alle Glaswaren, die zur Vorbereitung der polymerbeschichteten Oberflächen verwendet werden, vor der Verwendung durch Sterilisation bei trockener Hitze (250 °C für 30 Minuten) depyrogenisiert werden. Die Messung von Endotoxin in der Extraktlösung, wie hier beschrieben, kann zu einer Unterschätzung des Endotoxins auf der Materialoberfläche führen. Daher wird empfohlen, bei der Entwicklung eines Polymerbeschichtungsprotokolls die Endotoxin-Assay-Reaktion (d. h. die Schritte 2.6.4-2.6.6 für Testproben [Reagenzwasser] oder Spike-Kontrollen) direkt in den Vertiefungen durchzuführen, die die beschichtete Probe enthalten, um sicherzustellen, dass während des Beschichtungsprozesses keine Endotoxinquellen versehentlich in das System eingeführt werden.
- Bringen Sie alle Testproben (d. h. Extrakte) und Endotoxin-Assay-Reagenzien zur RT. Rekonstituieren Sie das chromogene Reagenz im Assay-Puffer und den Endotoxin-Standard in Reagenzwasser, lassen Sie es 5 Minuten lang auflösen und schwenken Sie es vorsichtig, bevor Sie es verwenden. Decken Sie alle Flaschen bei Nichtgebrauch mit Paraffinfolie ab.
- Erstellen Sie eine 5-8-Punkte-Standardverdünnungskurve des Endotoxinstandards, die von der unteren bis zur oberen Grenze des Assays reicht, indem Sie eine serielle Verdünnung des Endotoxinstandards in Reagenzwasser durchführen.
- Um eine Verstärkung oder Hemmung des Endotoxin-Assays in Testproben zu kontrollieren, bereiten Sie eine Positivkontrolle vor (auch als Spike-Kontrolle oder Spike-Probe bezeichnet), indem Sie eine bekannte Menge Endotoxin in einer nicht verwendeten Testprobenlösung verdünnen.
Anmerkung: Die Konzentration der Positivkontrolle sollte der Konzentration eines Standards in der Mitte der Normkurve entsprechen. Wenn die wiedergewonnene Menge des Endotoxin-Spikes (d. h. die Konzentration der Positivkontrolle abzüglich der Konzentration der nicht dotierten Testprobe) innerhalb von 50-200 % der nominalen Konzentration des Endotoxin-Spikes liegt, kann davon ausgegangen werden, dass die Extraktionslösung den Assay nicht signifikant beeinträchtigt.
- Geben Sie 50 μl Standards, Proben oder Spike-Kontrollen in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte in doppelter oder dreifacher Ausfertigung. Verwenden Sie Reagenzwasser als Negativkontrolle.
- Geben Sie 50 μl chromogenes Reagenz in jede Vertiefung. Geben Sie das Reagenz schnell in alle Vertiefungen. Verwenden Sie einen Timer, um die Zeit aufzuzeichnen, die benötigt wird, um Reagenz zu allen Wells hinzuzufügen. Die Platte mit einem Klebeverschluss abdecken und bei 37 °C inkubieren (die Inkubationszeit ist chargenabhängig und auf dem Analysezertifikat angegeben, das dem chromogenen Reagenzien-Kit beiliegt). Alternativ können Sie die Platte während der Inkubation alle 15 Minuten überprüfen, bis in allen Standard-Wells eine Farbänderung beobachtet wird.
- Nach der Inkubation 25 μl 50 % Essigsäure in jede Vertiefung geben (Endkonzentration von 10 % Essigsäure pro Vertiefung), um die Reaktion zu stoppen. Fügen Sie Essigsäure in der gleichen Reihenfolge hinzu, in der das chromogene Reagenz hinzugefügt wurde. Lesen Sie die Absorption der Platte mit einem Plattenlesegerät bei 405 nm ab. Flüssigkeit absaugen und Platte entsorgen.
Anmerkung: Die Zugabe von Essigsäure sollte bei jeder Vertiefung genauso lange dauern wie die Zugabe des chromogenen Reagenzes (± 30 s).
- Ultraviolett (UV)-sterilisieren Sie die Objektträger für 30 Minuten vor den Zellkulturexperimenten.
>3. Herstellung von Lysat aus 3T3-Zellen
- Züchten Sie 3T3-Zellen in mehreren T150-Kolben auf 70 % Konfluenz. Um Zellen zu lösen, aspirieren Sie Medien, waschen Sie die Oberfläche mit 5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und aspirieren Sie PBS. 5 ml rekombinantes Zelldissoziationsenzym tierischen Ursprungs (Table of Materials) zugeben und bei 37 °C für 3-5 min inkubieren.
- Die Zellen werden durch leichtes Hin- und Herkippen des Kolbens gelöst. Fügen Sie 5 ml PBS hinzu, um das rekombinante Enzym zu neutralisieren, das für die Zelldissoziation verwendet wird. Die aus den Kolben abgelösten Zellen in ein Zentrifugenröhrchen überführen und durch Pipettieren mischen. Führen Sie eine Zählung lebender Zellen mit einem Hämozytometer und einem Zellviabilitätsfarbstoff durch.
Anmerkung: Es wurde ein Zelldissoziationsenzym ausgewählt, das durch Verdünnung in PBS neutralisiert werden kann, um die Einführung von serumbasierten Proteinen in der Lysatzubereitung zu vermeiden. Wenn Trypsin verwendet wird, um Zellen zu dissoziieren, sollte es mit einer serumhaltigen Lösung neutralisiert werden, und eine zusätzliche PBS-Wäsche sollte durchgeführt werden, um die Menge an Serumproteinen zu reduzieren, die in die Lysatzubereitung übertragen werden.
- Die Zellen werden 5 Minuten lang bei 200 x g zentrifugiert. Der Überstand wird aspiriert und die Zellen werden im ursprünglichen PBS-Volumen (d. h. 10 mL x Anzahl der Kolben) resuspendiert, um das restliche Medium abzuwaschen. Wiederholen.
- Die Zellen erneut bei 200 x g für 5 min zentrifugieren und den Überstand aspirieren. Fügen Sie das PBS-Volumen hinzu, das erforderlich ist, um eine endgültige Zellkonzentration von 1 x 106 Zellen/ml zu erreichen. Stellen Sie die Zelllösung in einen -80 °C-Gefrierschrank, bis die Probe vollständig eingefroren ist (mindestens 2 Stunden).
- Die Zelllösung in einem 37 °C warmen Wasserbad auftauen. Sobald die Lösung vollständig aufgetaut ist, stellen Sie sie wieder in den -80 °C Gefrierschrank, bis sie vollständig gefroren ist. Wiederholen Sie dies für insgesamt 3 Gefrier-Tau-Zyklen.
- Führen Sie einen Mikrobicinchoninsäure (BCA)-Assay auf dem Zelllysat in einer Vielzahl von Verdünnungen (z. B. 1/100, 1/200, 1/500, 1/1000) durch, um die Proteinkonzentration zu bestimmen. Das Zelllysat wird auf eine Proteinkonzentration von 468,75 μg/ml verdünnt, aliquotiert und für die zukünftige Verwendung bei -80 °C gelagert.
Anmerkung: Die endgültige Proteinkonzentration in einer 48-Well-Platte beträgt 125 μg/cm2 (bezogen auf die Oberfläche einer Well, 0,75 cm2).
- Führen Sie einen Western Blot durch, um das Vorhandensein von DAMPs im Lysat zu beurteilen (z. B. Hitzeschockprotein 60 [HSP60], High Mobility Group Box 1 [HMGB1]), indem Sie 40-60 μg Lysatprotein in einem Ladepuffer auf ein 1,5 mm dickes 10%iges Polyacrylamid-Gel laden und die Standard-Western-Blot-Verfahren befolgen.
>4. Bewertung der Wirkung von adsorbierten Proteinschichten und Toll-like-Rezeptoren auf die NF-κB-Aktivität von Makrophagen
HINWEIS: Ein Schema des experimentellen Arbeitsablaufs und des Plattenlayouts finden Sie in Abbildung 1A bzw. Abbildung 2.
- Züchten Sie Reportermakrophagen in einem Kolben geeigneter Größe bis zu 70 % Konfluenz. Aspirieren Sie das Medium, waschen Sie die Oberfläche mit PBS und aspirieren Sie PBS. Fügen Sie das rekombinante Zelldissoziationsenzym hinzu und inkubieren Sie es 8 Minuten lang bei 37 °C.
- Die Zellen werden durch festes Klopfen an den Seiten des Kolbens gelöst. Inaktivieren Sie das rekombinante Zelldissoziationsenzym durch Zugabe eines gleichen Volumens an Wachstumsmedien (mit 10 % FBS). Führen Sie eine Zählung lebender Zellen mit einem Hämozytometer und einem Zellviabilitätsfarbstoff durch.
Anmerkung: Die erwartete Lebensfähigkeit der Reportermakrophagen nach einer 8-minütigen Inkubation im Zelldissoziationsenzym beträgt 90%.
- Zellen bei 200 x g für 5 min zentrifugieren. Überstand aspirieren und im ursprünglichen PBS-Volumen resuspendieren, um die Zellen zu waschen. Zentrifugieren Sie erneut und resuspendieren Sie die Zellen bei 7,3 x 105 Zellen/ml in Assay-Medien (mit hitzeinaktiviertem FBS).
- Trennen Sie die Zellsuspension in 3 verschiedene Röhrchen: TLR4-Inhibitor, Anti-TLR2 und unbehandelt. Inkubieren Sie Zellen mit 1 μg/ml TLR4-Inhibitor für 60 min bei RT oder mit 50 μg/ml Anti-TLR2 für 30 min bei RT.
- Geben Sie 200 μl Lysat, 10 % FBS, 10 % kommerzielles Mausplasma (Table of Materials) oder eine Mischung der Proteinlösungen auf eine 48-Well-Platte (oder gleichwertig) und lassen Sie das Protein für die gewünschte Zeit (d. h. 30 min, 60 min oder 24 h) bei 37 °C adsorbieren. Aspirieren Sie Proteinlösungen aus den Vertiefungen, verwenden Sie für jede Proteinlösung eine frische Pasteurpipette und waschen Sie die Oberflächen 5 Minuten lang mit 250 μl PBS. Wiederholen Sie dies für insgesamt 3 Wäschen.
Anmerkung: Dieser Schritt muss je nach gewünschter Adsorptionszeit möglicherweise früher im Protokoll gestartet werden. Passen Sie das Protokoll entsprechend an.
- Nach der Inkubationszeit mit dem TLR4-Inhibitor oder Anti-TLR2 pipettieren Sie die Zellen, um sie zu resuspendieren. Geben Sie 200 μl Zelllösung in jede Vertiefung
.
- Für die TLR2-positive Kontrollbedingung fügen Sie Pam3CSK4 (Pam3Cys-Ser-(Lys)4) in eine Endkonzentration von 150 ng/ml hinzu. Für die TLR4-Positivkontrollbedingung fügen Sie Lipopolysaccharid (LPS) bis zu einer Endkonzentration von 1,5 μg/ml hinzu. Die Zellen werden 20 Stunden lang bei 37 °C inkubiert.
- Nehmen Sie eine Probe von 20 μl Überstand aus jeder Vertiefung und geben Sie sie in doppelter Ausführung in eine 96-Well-Platte. Nehmen Sie drei Vertiefungen mit 20 μl Assay-Medium als Hintergrundkontrolle auf. Geben Sie 200 μl SEAP-Reporter-Assay-Reagenz in jede Vertiefung. Die Platte mit einem Klebeverschluss abdecken und 2,5 h bei 37 °C inkubieren.
Anmerkung: Die Inkubationszeit kann je nach Versuchsbedingungen variieren und sollte für einen starken Unterschied in der Absorption zwischen positiven und negativen Kontrollvertiefungen optimiert werden.
- Den Rest des Überstands in ein 1,5-ml-Röhrchen (pro Vertiefung) überführen. Zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei 1.000 x g, um alle Rückstände zu pelletieren. Übertragen Sie den Überstand in ein neues 1,5-ml-Röhrchen und lagern Sie es bei -80 °C. Analysieren Sie den Überstand auf das Vorhandensein von proinflammatorischen Zytokinen (z. B. Tumornekrosefaktor alpha (TNF-α), Interleukin 6) mittels Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA).
- Entfernen Sie die Klebeplattendichtung. Lesen Sie die Absorption der Platte mit einem Plattenlesegerät bei 635 nm ab. Flüssigkeit absaugen und Platte entsorgen.
