>1. Erzeugung von CAR-kodierenden Lentiviren
HINWEIS: Sobald die Konstruktion des spezifischen chimären Antigenrezeptors (CAR) T-Zell-Plasmids abgeschlossen ist (CD47 und andere), werden lentivirale CARs durch das Standardverfahren erzeugt, wobei 293 FT-Zellen, eine lentivirale Verpackungsmischung und Transfektionsmittel (siehe Materialtabelle) wie beschrieben verwendet werden. Verwenden Sie anschließend ein quantitatives RT-PCR-Kit (Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion) und einen Thermocycler (siehe Materialtabelle), um den Virustiter zu bestimmen, indem Sie die lentivirale RNA-Menge gemäß dem Protokoll des Herstellers messen. Es ist wichtig, dass alle lentiviralen Eingriffe streng nach den Sicherheitsanforderungen durchgeführt werden.
- 15 x 106 HEK293FT Zellen in Dulbeccos modifiziertem Eagle's Medium (DMEM) säen und über Nacht bei 37 °C in einer 150-mm-Schale in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % Kohlendioxid (CO 2) inkubieren.
- Bereiten Sie zwei 15-ml-Röhrchen mit Transfektionskomplex vor. Das erste Röhrchen enthält lentivirale Vektorplasmid-DNA (5 μg) und eine lentivirale Verpackungsmischung (22,5 μg) in 2,5 ml Transfektionsverdünnungslösung. Das zweite Röhrchen enthält 82,5 μl Transfektionsreagenz in 2,5 mL Transfektionsverdünnungslösung (siehe Materialtabelle).
- Pipettieren Sie den Inhalt von Röhrchen 1 in Röhrchen 2 und inkubieren Sie die Mischung 15 Minuten lang bei Raumtemperatur.
- Den Inhalt des Röhrchens tropfenweise in die Schale mit HEK293FT Zellen geben und die Probe über Nacht bei 37 °C in einem befeuchteten 5%igen Kohlendioxid-CO 2-Inkubator inkubieren.
- Ersetzen Sie am nächsten Tag das vorhandene Medium durch 19 mL frisches DMEM-Kulturmedium und inkubieren Sie die Zellen über Nacht im befeuchteten 5 %CO 2 -Inkubator bei 37 °C.
- Übertragen Sie das Medium aus der Schale in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen. Bewahren Sie das Röhrchen mit dem virushaltigen Medium im Kühlschrank auf.
- Wiederholen Sie den obigen Vorgang, fügen Sie frisches DMEM hinzu und sammeln Sie es nach 1 Tag erneut.
- Kombinieren Sie zwei Sammlungen des Mediums in einem Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 2.000 x g für 30 min bei 4 °C.
- Übertragen Sie den größten Teil des Lentivirus-haltigen Überstands in ein ultraklares Zentrifugenröhrchen. Lassen Sie ein Mindestvolumen, etwa 1 ml des Überstands, um eine Störung des Pellets zu vermeiden, das Zellen und/oder Ablagerungen enthalten kann.
- Den oben geklärten Überstand bei 110.000 x g für 100 min bei 4 °C ultrazentrifugieren.
- Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und geben Sie vorsichtig 100 μl DMEM-Medium in das Viruspellet am Boden des Röhrchens. Lassen Sie die Tube 15 Minuten auf Eis. Mischen Sie die Lösung vorsichtig und aliquotieren Sie die Lentivirus-Lösung in vorgekühlte sterile Röhrchen. Lagern Sie diese Virus-Suppenröhrchen in einem -80 °C Gefrierschrank.
- Verwenden Sie ein quantitatives RT-PCR-Kit, um den Titer des Lentivirus gemäß dem Protokoll des Herstellers zu bestimmen, das lentivirale RNA extrahiert und misst.
>2. Erzeugung und Expansion von CAR-T-Zellen
- Zuvor eingefrorene mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) des Menschen (ca. 1 x 106 bis 2 x 106 Zellen) in 1 ml CAR-T-Zellmedium mit der gleichen Anzahl CD3/CD28-beschichteter Mikrokügelchen (siehe Materialtabelle) aktivieren und die Zellen bei 37 °C in einem befeuchteten 5 % CO2 -Inkubator für 24 h inkubieren.
- Tauen Sie ein Aliquot des Lentivirus-Stammes auf Eis auf.
- 1 μl Transduktionsverstärker in die Vertiefung mit den Zellen geben und mischen.
- Geben Sie Lentiviren mit einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 5:1 zu den Zellen und mischen Sie vorsichtig. Wiederholen Sie diesen Schritt am nächsten Tag (24 Stunden nach der ersten Transduktion).
- Überwachen Sie das Wachstum der T-Zellen alle 2-3 Tage. Fügen Sie mehr frisches CAR-T-Zellmedium hinzu, um die Zellen bei einer Dichte von 1 x 106 bis 2 x 106 Zellen/ml zu halten.
- Frieren Sie die CAR-T-Zellen mit einem Standardprotokoll unter Verwendung einer Gefrierlösung ein (siehe Materialtabelle).
- Tauen Sie CAR-T-Zellen mit einer Standardmethode auf und kultivieren Sie sie im CAR-T-Zellmedium für etwa ~2-4 h mit Interleukin-2, IL-2 (300 Einheiten/ml), bevor Sie sie auf den Assay auftragen.
>3. Nachweis der CAR-Expression durch Durchflusszytometrie
- Übertragen Sie 3 x 105 CAR-T-Zellen und nicht transduzierte T-Zellen in zwei separate 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
- Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 300 x g für 2 min und resuspendieren Sie die Zellen in 200 μl Fluoreszenz-aktiviertem Zellsortierpuffer (FACS) mit 1 % humanem Serum.
- Pipettieren Sie 100 μl Zelllösung in zwei 5-ml-Polystyrol-FACS-Röhrchen und halten Sie die Röhrchen 5 Minuten lang auf Eis.
- 1 μl biotinyliertes Ziegen-Anti-Maus-Mittel F(ab')2 werden in ein Röhrchen jedes Zelltyps gegeben. Geben Sie dann 2 μl Phycoerythrin, einen PE-markierten Anti-Tag-Antikörper (siehe Materialtabelle) in das andere Röhrchen jedes Zelltyps. Gut vermischen und 30 min auf Eis inkubieren.
- Waschen Sie die Zellen mit 3 mL FACS-Puffer in jedem Röhrchen und zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 300 x g für 5 min; entsorgen Sie die Überstände und den Vortex ganz kurz oder schütteln Sie die Röhrchen kurz, um die Zellen in der Restflüssigkeit wieder zu suspendieren.
- Geben Sie 2 μl Anti-CD3-Antikörperlösung mit antigenpräsentierenden Zellen (APC) und 2 μl 7-Aminoactinomycin D (7-AAD)-Antikörperlösung (siehe Materialtabelle) in jedes Röhrchen. In das Röhrchen mit den mit Anti-F(ab')2 Ab gefärbten Zellen wird 1 μl PE-markiertes Streptavidin gegeben. Kurz mischen und die Röhrchen weitere 30 Minuten auf Eis inkubieren.
- Verwenden Sie FACS-Puffer, um die Zellen erneut zu waschen, wie in Schritt 3.5 beschrieben, und geben Sie zusätzlich 200 μl FACS-Puffer in jedes Röhrchen.
- Verwenden Sie die Durchflusszytometrie, um die Zellen zu analysieren, indem Sie zuerst die T-Zellen in einem Vorwärtsstreu- vs. Seitenstreudiagramm und dann die lebenden Zellen (7-AAD-negativ) in einem CD3- vs. 7-AAD-Diagramm angrenzen. Der letzte Schritt besteht darin, Anti-Tag, Anti-ScFv oder Anti-F(ab')2 vs. CD3 zu analysieren.
>4. Echtzeit-Zytolyse-Wirksamkeitsassay (RTCA)
HINWEIS: Führen Sie den RTCA-Assay gemäß den vom Hersteller empfohlenen Bedingungen durch. Kurz gesagt, zuerst die Zielzellen in den Vertiefungen der E-Platte plattieren, gefolgt von der Zugabe von CAR-T-Zellen am nächsten Tag. Die Zytolyseaktivität von CAR-T-Zellen gegenüber Zielzellen wird in Echtzeit überwacht. T-Zellen und Mock-transduzierte T-Zellen (Mock CAR T-Zellen) werden als negative Effektorzellkontrollen verwendet. Das folgende Protokoll beschreibt einen in vitro real-time Zytolyse-Wirksamkeitsassay für adhärente Tumorzelllinien.
- Geben Sie 100 μl Zielzellkulturmedium in jede Vertiefung der xCELLigence E-Platte, platzieren Sie die Platte in dem xCELLigence Gerät und nehmen Sie eine Hintergrundmessung vor. Übertragen Sie dann die E-Platte in eine Gewebekulturhaube für die Zellaussaat.
- Verwenden Sie ein Standardprotokoll, um Zielkrebszellen aus dem Kulturgerät zu trypsinisieren. Übertragen Sie dann die Zellen in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen und fügen Sie frisches Kulturmedium bis zu 15 ml hinzu. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation für 5 min bei 200 x g. Entsorgen Sie den Überstand, fügen Sie 5 ml frisches Medium hinzu und verwenden Sie eine serologische Pipette, um das Zellpellet vorsichtig wieder zu suspendieren. Zählen Sie die Dichte lebender Zellen mit einem Hämozytometer und einem Mikroskop.
- Passen Sie die Zelldichte entsprechend an und geben Sie dann 100 l der Zellsuspension in jede Vertiefung der E-Platte. Die Zielzellzahl liegt typischerweise bei etwa 10.000 Zellen/Well für adhärente Zelllinien (BxPC3, Hela-CD19 und SKOV3) oder 30.000 Zellen/Well für Suspensionszellen wie Raji (siehe unten für Details zur Vorbeschichtung von Wells mit Antikörpern zur Bindung flüssiger Krebszellen).
- Äquilibrieren Sie die E-Plate 30 Minuten lang bei Raumtemperatur, damit sich die Zellen gleichmäßig auf dem Boden der Vertiefung absetzen können (dies ist wichtig; überspringen Sie diesen Schritt nicht).
- Setzen Sie die E-Plate in das xCELLigence-Gerät im Zellkultur-Inkubator ein und beginnen Sie mit der Impedanzmessung, die automatisch alle 15 Minuten als Zellindex über der Zeit angezeigt wird.
- Bereiten Sie am nächsten Tag Effektor-CAR-T-Zellen vor. Stellen Sie sicher, dass Sie die entsprechenden Kontrollen (d. h. Mock-CAR-T-Zellen, nicht transduzierte Kontroll-T-Zellen und/oder nicht verwandte CAR-T-Zellen) im Voraus vorbereiten, um sicherzustellen, dass alle Zellen gleichzeitig bereit sind. Stellen Sie die Effektorzellen und die Kontrollzellen auf die richtige Dichte ein und bereiten Sie serielle Verdünnungen vor, um sicherzustellen, dass die gewünschten E:T-Verhältnisse erreicht werden, wenn in Schritt 9 100 μl Effektorzellsuspension in jede Vertiefung gegeben werden.
- Pausieren Sie die xCELLigence Datenerfassung und bringen Sie die E-Plate aus dem Inkubator in eine Zellkulturhaube.
- Entfernen Sie 100 μl Medium aus jeder Vertiefung. Die Menge des Restmediums in jeder Vertiefung beträgt nun 100 μl.
- Fügen Sie 100 μl seriell verdünnte Effektor-CAR-T-Zellen oder andere Kontrollzellen (d. h. Mock-CAR-T-Zellen) hinzu, um die gewünschten E:T-Verhältnisse zu erreichen.
- Äquilibrieren Sie die E-Platte 30 Minuten lang bei Raumtemperatur, damit sich die Effektorzellen absetzen können, und setzen Sie die E-Platte dann wieder in das xCELLigence-Gerät ein. Setzen Sie die Datenerfassung fort.
- Falls gewünscht, kann die xCELLigence-Datenerfassung zu wichtigen Zeitpunkten unterbrochen und die Platte entfernt werden, um kleine Proben zu entnehmen, die mit orthogonalen Assays analysiert werden sollen (d. h. Messung der Zytokinproduktion durch Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) oder Durchflusszytometrie).
- Messen Sie im EGFR-GITR-CD3 CAR-T-Zell-Experiment die Interferon-Gamma (IFNγ)-Ausbeute mit einem ELISA-Kit (befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers; siehe Materialtabelle).
Anmerkung BEZÜGLICH DER VERWENDUNG VON FLÜSSIGEN KREBSARTEN: Um nicht-adhärente hämatologische Krebszellen zu testen, werden vor dem Hinzufügen von Zellen zunächst die Vertiefungen der E-Platte mit einem Antikörper beschichtet, der spezifisch für ein Antigen ist, das auf der Oberfläche der Krebszellen exprimiert wird. Für die Raji-B-Zelllinie wird ein Tethering-Reagenz auf Basis von Anti-CD40 verwendet (siehe flüssiges Tumortötungs-Assay-Kit in der Materialtabelle). Im Folgenden finden Sie das Verfahren zum Beschichten der Platte:
- Das Tethering-Reagenz (Anti-CD40) mit Tethering-Puffer auf eine Konzentration von 4 μg/ml verdünnen.
- Geben Sie in einer Gewebekulturhaube 50 μl des verdünnten Tethering-Reagenzes in jede Vertiefung der E-Platte. Lassen Sie die E-Plate 3 h bei Raumtemperatur oder in einem 37 °C heißen Inkubator.
- Entfernen Sie das Tethering-Reagenz und waschen Sie die E-Plate mindestens 2x mit Waschpuffer. Zu diesem Zeitpunkt ist die E-Plate bereit für die Aussaat der Raji-Zielzellen (30.000 Zellen/Well).
- Fahren Sie mit Schritt 4.1 (oben) fort, um den Rest des Verfahrens durchzuführen.
