>1. Vorbereitung der Medien und Lösungen
- Bereiten Sie das Nährmedium vor: RPMI-1640 mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), pH 7,4.
- Präparation des Assay-Kulturmediums: RPMI-1640 ohne Phenolrot, aber mit 1 % FBS, pH 7,4.
- Aufbereitung der Zellwaschlösung: Mg- und Ca-freie Lösung mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) von Dulbecco mit 0,02 % EDTA, pH 7,4.
- Bereiten Sie die Zellablösungslösung vor: 0,125 % Trypsin mit 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA).
- 100 ml einer 0,25%igen Trypsin-EDTA-Lösung auftauen und in einen sterilen 500-ml-Kolben überführen.
- Mischen Sie es mit 100 mL Zellwaschlösung und geben Sie 15 mL Aliquots in sterile 15 mL Röhrchen. Bis zur Verwendung bei -70 bis -80 °C lagern.
- Diese Lösungen werden durch eine 0,22-μm-Membran filtriert und vor der Verwendung mindestens 30 Minuten lang auf 37 °C erwärmt.
- Bereiten Sie Apoptose-Induktions-Stammlösung TNFα-Lösung mit 3,3 μg/ml vor.
- 20 μg TNFα mit 500 μl filtersterilisiertem Wasser in seinem Primärbehälter auflösen und bis zur vollständigen Auflösung mischen.
- In ein steriles 15-ml-Röhrchen umfüllen und 5,5 mL DPBS Mg- und Ca-freie Lösung in dieses Röhrchen geben. Vorsichtig mit einem Vortex-Mixer mischen.
- Aliquotieren Sie die Lösung in 70-μl-Portionen. Jedes Aliquot in 0,5 mL Mikroröhrchen geben und bei -80 °C lagern.
- Apoptose-Induktionslösung herstellen: TNFα-Lösung bei 40 ng/ml.
- Tauen Sie ein Aliquot der Apoptose-Induktions-Stammlösung auf und inkubieren Sie es 10 Minuten lang in einem Wasserbad bei 25 °C.
- Verdünnen Sie die Apoptose-Induktions-Stammlösung auf 40 ng/ml, indem Sie 61 μl 3,3 μg/ml TNFα-Lösung zu 4,939 ml Assay-Kulturmedium in einem sterilen 15-ml-Röhrchen hinzufügen.
- Mit einem Wirbelmischer 10 Sekunden lang mischen; diese Lösung muss vor der Verwendung frisch zubereitet werden.
- Erwärmen Sie die Lösung mindestens 30 Minuten lang auf 37 °C, bevor Sie sie im Neutralisationsassay verwenden.
- Bereiten Sie die Substratlösung vor: Caspase 3/7 Glo Lösung.
- Tauen Sie die Caspase-Pufferlösung (Caspase 3/7 Glo-Puffer) vor Gebrauch 12 Stunden lang auf.
- Lassen Sie die Caspase-Pufferlösung und das Substrat (Caspase 3/7 Glo-Substrat) vor dem Mischen 30 Minuten lang getrennt bei 25 ± 5 °C ruhen.
- 10 ml der Caspase-Pufferlösung in das Substratfläschchen überführen und durch Inversion mischen.
- Bis zur Verwendung bei 25 ± 5 °C lichtgeschützt aufbewahren.
Anmerkung: Die Lösung ist bei Raumtemperatur 6 h haltbar.
>2. Zellkultivierung und -zählung
- Auftauen der Zellen und die erste Subkultur.
- Nehmen Sie ein Fläschchen mit WEHI 164-Zellen bei -80 °C aus dem Gefrierschrank und stellen Sie sie in ein Eisbad.
- Pipettieren Sie mit 1 ml vorgewärmtem Kulturmedium auf und ab, bis die gefrorenen Zellen vollständig aufgetaut sind.
- Geben Sie 9 ml vorgewärmtes Nährmedium auf ein steriles 15-ml-Röhrchen.
- Die Zellsuspension wird in das sterile 15-ml-Röhrchen überführt und fünfmal durch Inversion vorsichtig gemischt.
- Die Zellsuspension bei 125 x g für 3 min zentrifugieren. Den Überstand verwerfen und das Zellpellet disaggregieren.
- Geben Sie 5 ml Nährmedium in das Röhrchen. Mischen, bis die Zellen vollständig resuspendiert sind.
- Für die Zellzählung 50 μl der Zellsuspension in ein 500 μl Mikroröhrchen überführen und mit 50 μl 0,4 % Trypanblau mischen. Zählen Sie die Zellen und stellen Sie sie auf 0,5 x 106 Zellen/ml ein. Siehe Schritt 2.2 unten.
- 13 ml vorgewärmtes Kulturmedium werden in einen 75-ml-Zellkulturkolben gegeben.
- Geben Sie genügend Zellsuspensionsvolumen aus Schritt 2.1.6 ab, um 0,5 x 106 Zellen/ml im Zellkulturkolben zu erreichen, und inkubieren Sie bei 37 °C und 5 % CO2 über Nacht.
- Zellzählung.
- Unter Verwendung der Lösung aus Schritt 2.1.6 werden 0,05 ml auf ein Hämozytometer übertragen und die Zelldichte unter dem Mikroskop unter Verwendung des Trypanblau-Ausschlusses bestimmt.
- Quantifizieren Sie die Gesamtzahl der Zellen und lebensfähigen Zellen.
- Stellen Sie die Zellsuspensionen auf 0,5 x 106 Zellen/ml.
VKulturmedium (ml) = 
V-Kulturmedium (ml) = (5 ml -V-Zellsuspension)
V-Kulturmedium (ml) = Angepasstes Volumen der WEHI 164-Zellsuspension
NVC = Anzahl lebensfähiger WEHI 164 Zellen/ml
V-Kulturmedium (ml) = Assay-Kulturmediumvolumen, das der Zellsuspension zugesetzt wird, um 0,5 x 106 Zellen/ml
zu erreichen
0,5 x 106 = Ziel-Zelldichte
- Die Zellablösung und die zweite und dritte Subkultur.
Anmerkung: Ein Vakuumsystem kann verwendet werden, um die Lösungen aus den Kolben zu entfernen. Es können Einweg- oder sterile Glaspipetten verwendet werden. Wenn die Pipette oben eine Wattestopfung hat, muss diese vor dem Gebrauch entfernt werden.
- Entfernen Sie das Nährmedium mit einer sterilen 1-ml-Pipette und einem Vakuum aus dem Zellkultur-T-Kolben.
- Geben Sie 5 ml Zellwaschlösung in den Kultur-T-Kolben, mischen Sie vorsichtig und verwerfen Sie die Lösung. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.
Anmerkung: Die vollständige Entfernung des Kulturmediums ist entscheidend für eine effiziente Zellablösung.
- 15 ml Zellablösungslösung in den T-Kolben geben und 3 min in einem Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2 stehen lassen.
- Unter dem Mikroskop ist zu überprüfen, ob in der Innenwand des Kolbens keine Zellen vorhanden sind. Entnehmen Sie die Zellen mit einer sterilen 20-ml-Pipette aus dem Kultur-T-Kolben und geben Sie sie in ein steriles 50-ml-Röhrchen ab.
- Die Zellsuspension wird 3 Minuten lang bei 125 x g zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und das Pellet mit weiteren 5 ml Nährmedium resuspendiert.
- Zählen Sie die Zellen und fügen Sie genügend Kulturmedium hinzu, um die gewünschte Zellkonzentration gemäß Gleichung 1 zu erreichen.
- Diese Suspension wird in einen 72 cm2 T-Kolben gegeben und über Nacht bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert.
- Subkulturieren Sie die Zellen mindestens zweimal, bevor Sie sie im Neutralisationsassay verwenden. Wiederholen Sie die Schritte 2.3.1 bis 2.3.8 für die nächsten zwei Tage.
- Assay-Zellsuspension.
- Wählen Sie eine WEHI 164-Subkultur aus, die über mindestens drei Durchgänge verfügt. Siehe Schritt 2.1.
- Trennen und zählen Sie die Zellen gemäß den Schritten 2.2 und 2.3 dieses Protokolls.
- Verdünnen Sie die Zellsuspension gemäß Gleichung 1 auf 0,5 x 106 Zellen/ml.
- Verwenden Sie diese zelluläre Suspension für den Neutralisationsassay. Mischen Sie alle Zellsuspensionen vor der Verwendung mit einem Vortex-Mischer.
>3. Antikörpervorbereitung und Verdünnungen
- Quantifizierung der mAbs.
- Bestimmen Sie die Konzentration der Referenzsubstanz, der Kontrollprobe und der analytischen Probe durch UV-Absorption bei 280 nm unter Verwendung ihres Massenauslöschungskoeffizienten (1,39).
Anmerkung: Die ursprünglichen Konzentrationen könnten den Etiketten von Arzneimitteln entnommen werden. Dies muss jedoch durch UV-Absorption nachgewiesen werden.
- mAb-Verdünnungen.
- Verdünnen Sie alle Proben unabhängig voneinander in dreifacher Ausfertigung mit DPBS Mg- und Ca-freier Lösung in 2-ml-Mikroröhrchen bis zu 2 mg/ml. Diese Konzentration wird durch UV-Absorption in dreifacher Ausfertigung mit DPBS Mg- und Ca-freier Lösung als Blindwert bestätigt.
- Mischen Sie die Stammproteinlösungen 5 Sekunden lang mit einem Vortex-Mixer.
- Verdünnen Sie 100 μl jeder 2 mg/ml mAb-Lösung mit 0,9 ml des Assay-Kulturmediums.
- 5 s lang mit einem Vortex-Mixer mixen.
Anmerkung: Diese Lösungen haben eine Konzentration von 200 μg/ml. Verdünnungen müssen für jedes Dreifachpräparat durchgeführt werden.
- Verdünnen Sie 10 μl jeder 200 μg/ml-mAb-Lösung mit 0,99 mL des Assay-Kulturmediums. Mit einem Vortex-Mixer 5 s lang mixen. Diese Lösungen haben eine Konzentration von 2 μg/ml. Führen Sie für jedes Dreifachpräparat serielle Verdünnungen durch, bevor Sie sie im Neutralisationsassay verwenden.
- Führen Sie Anti-TNFα-mAb-Verdünnungen in drei unabhängigen Mikrotiterplatten durch. Machen Sie von jedem unabhängigen Triplakat ein Duplikat und geben Sie es in eine Mikrotiterplatte, wie in Tabelle 1 gezeigt. Referenzsubstanz
Führen - Sie mAb-Verdünnungen jeder Referenz, Probe oder Kontrolle durch, wie in Tabelle 2.
gezeigt
Anmerkung: Die in dieser Tabelle beschriebenen Anti-TNFα-mAb-Konzentrationen sind nicht die Endkonzentrationen im Neutralisationsassay.
- Bewahren Sie die Platten bis zur Verwendung bei 25 ± 5 °C auf.
>4. Neutralisationsassay mit WEHI 164 Zellen
- Mischen Sie durch Vortexen aller Zellsuspensionen (0,5 x 106 Zellen/ml) vor der Abgabe in einem beliebigen Schritt dieses Protokolls.
Anmerkung: In diesem Abschnitt erwärmen Sie jede Lösung vor der Verwendung 30 Minuten lang auf 37 °C.
- Übertragen Sie 50 μl der Zellsuspension in jede der 60 Vertiefungen der Mikrotiterplatten, indem Sie von Spalte 2 bis 11 und von Linie B nach G wechseln.
- Übertragen Sie 50 μl mAb-Referenz-, Proben- und Kontrollverdünnungen in Mikrotiterplatten. Befolgen Sie das in Abbildung 1 dargestellte Muster.
- Geben Sie 50 μl der Apoptose-Induktionslösung in jede Vertiefung
.
- Verwenden Sie zelluläre Kontrollen von 50 μl WEHI 164-Zellen, die in drei Vertiefungen abgegeben werden. Bringen Sie jede Vertiefung mit einem Assay-Kulturmedium auf ein Endvolumen von 150 μl.
- Verwenden Sie eine Zytotoxizitätskontrolle aus einer Mischung aus 50 μl WEHI 164-Zellen und 50 μl Apoptose-Induktionslösung. Bringen Sie jede Vertiefung mit einem Assay-Kulturmedium auf ein Endvolumen von 150 μl.
- Für die TNFα-Kontrolle verwenden Sie 50 μl der Apoptose-Induktionslösung und bringen Sie sie mit dem Assay-Kulturmedium auf 150 μl.
- Verwenden Sie für den Blindwert allein 150 μl des Assay-Kulturmediums.
- Füllen Sie die verbleibenden Vertiefungen mit 150 μl Kulturmedium, um Verdampfungseffekte auf der Platte zu vermeiden.
- Wiederholen Sie die Schritte 4.1.1 bis 4.1.9 zweimal in zwei weiteren Mikroplatten.
Anmerkung: Die mAb-Endkonzentrationen in der Mikroplatte betragen: 0,666, 0,333, 0,167, 0,111, 0,083, 0,056, 0,042, 0,028, 0,014 und 0,004 μg/ml.
- Laden Sie die Proben in Mikrotiterplatten, wie in Abbildung 1 gezeigt
- Die drei Platten bei 37 °C und 5 % CO2 16 ± 2 h inkubieren.
- Lassen Sie das Caspase 3/7 Glo Reagenz vor der Verwendung 30 Minuten lang bei 25 ± 5 °C stehen.
- Geben Sie 100 μl dieses Reagenzes in alle Vertiefungen, einschließlich der Proben und Kontrollen.
- Schütteln Sie die Platten mit einem Mikrotiterplatten-Vortex-Mischer 3 Minuten lang bei 25 ± 5 °C unmittelbar nach der Abgabe in die Vertiefungen.
- Die Platten 2,5 ± 0,5 h bei 25 ± 5 °C lichtgeschützt inkubieren.
- Setzen Sie die Mikrotiterplatten in das Luminometer ein und schließen Sie den nächsten Abschnitt ab.
>5. Analyse der Ergebnisse
- Wählen Sie mithilfe der Software für die Lumineszenzerkennung den Lumineszenzmodus und die Endpunktfunktion aus.
- Wählen Sie eine 96-Well-Platte mit klarem Boden und ihre 80 internen Wells, mit Ausnahme der Spalten 1 und 12.
- Wählen Sie eine Integrationszeit von 1.250 ms und 10 s für das Mischen der Mikroplatte vor dem Ablesen.
- Wählen Sie die Vertiefungen aus, in denen die Referenzsubstanz, die Analysesubstanz und die Kontrollprobe platziert werden sollen, und identifizieren Sie sie mit den entsprechenden Konzentrationen.
- Lesen Sie die Proben, die in den Mikrotiterplatten platziert sind, mit dem Luminometer ab.
- Verwenden Sie eine vierte Parametergleichung für die Analyse der Ergebnisse. Darstellung einer Dosis-Wirkungs-Kurve, wie in Abbildung 2.
dargestellt
HINWEIS: In der vierten Parametergleichung ist C die effektive Konzentration 50 (EC50). Dieser Wert wird verwendet, um die Referenzsubstanz, die Analysenprobe und die Kontrollprobe mit Hilfe der Effektorfunktion zu vergleichen.
- Für die Berechnung der relativen Potenzen ist die Referenzsubstanz auf 100 % zu fixieren, die Potenzen der Probe zu berechnen und entsprechend zu kontrollieren.
Anmerkung: Diese Werte sind in Abbildung 3 dargestellt.
Tabelle 1: Mikroplatten-Probenarrays. Ein vollständiger Neutralisationsassay muss in drei Mikrotiterplatten innerhalb der Koordinaten B2 bis G11 durchgeführt werden. Die zufällige Abgabe von Referenz-, Analyse- und Kontrollproben ermöglicht es den Forschern, jegliche Verzerrung im Assay zu überprüfen.
| Tafel 1 | Tafel 2 | Tafel 3 |
| Brunnen | Probe | Brunnen | Probe | Brunnen | Probe |
| B2:B11 | Referenzsubstanz | B2:B11 | Kontrollbeispiel | B2:B11 | Analytische Probe |
| C2:C11 | C2:C11 | C2:C11 |
| D2:D11 | Analytische Probe | D2:D11 | Referenzsubstanz | D2:D11 | Kontrollbeispiel |
| E2:E11 | E2:E11 | E2:E11 |
| F2:F11 | Kontrollbeispiel | F2:F11 | Analytische Probe | F2:F11 | Referenzsubstanz |
| G2:G11 | G2:G11 | G2:G11 |
Tabelle 2: Anti-TNFα mAb-Verdünnungen. Die seriellen Verdünnungen von anti-TNFα-mAbs sind in dieser Tabelle dargestellt. Die in dieser Tabelle beschriebenen Endkonzentrationen entsprechen nicht den Konzentrationen im Assay, bei denen die Anti-TNFα-mAbs um den Faktor 3 verdünnt wurden (mAb-Verdünnung + Kulturmedium + Zellsuspension). Fett gedruckte Linien stellen Verdünnungen dar, die von den Zeilen 3, 5, 7, 9 und 10 kommen; Nicht fett gedruckte Linien stellen die Verdünnung aus den Zeilen 3, 4 und 6 dar. Diese seriellen Verdünnungen werden kurz vor der Durchführung des Neutralisationsassays durchgeführt. Es muss darauf geachtet werden, dass vor dem Abgeben der Verdünnungen dreimal auf und ab pipettiert wird.
kg
| Platten-Säule | Volumen des Assay-Kulturmediums (μL) | Volumen der Referenzsubstanz, der analytischen Probe oder der Kontrollprobe (uL) | Konzentration in der Testplatte (ng/ml) |
| arabische Ziffer | 0 | Nr. 230 | Das Jahr 2000 |
| 3 | 150 | 150 von Linie 2 | 1000 |
| 4 | 75 | 75 von Zeile 3 | 500 |
| 5 | 100 | 50 von Zeile 3 | 333 |
| 6 | 75 | 75 ab Zeile 4 | 250 |
| 7 | 75 | 75 von Zeile 5 | Nr. 166 |
| 8 | 75 | 75 ab Zeile 6 | 125 |
| 9 | 75 | 75 ab Zeile 7 | Nr. 83 |
| 10 | 75 | 75 ab Zeile 9 | Nr. 41 |
| 11 | 150 | 75 ab Zeile 10 | 13 |
