>1. Produktion naiver MoDCs
HINWEIS: Vollblutproben wurden von einem einzigen pathogenfreien Kalb durch Punktion der Halsvene mit heparinisierten Vacutainern gewonnen (acht 9-ml-Blutröhrchen wurden für diese Studie verwendet). Transportieren Sie das Blut in einer Eisbox. Lagern Sie die Proben für die spätere Verwendung bei 2-4 °C oder verarbeiten Sie sie sofort. Halten Sie das Blut rotieren, um Blutgerinnsel zu vermeiden. Sterilisieren Sie die Vacutainer mit 70% Ethanol. Alle folgenden Experimente wurden mit einer biologischen Probe und sechs technischen Replikaten durchgeführt.
- Dichtegradientenzentrifugation zur Isolierung von PBMCs aus dem heparinisierten Blut
- Mischen Sie das Blut gut, indem Sie es 10x umdrehen.
- Übertragen Sie mit einer 10-ml-Pipette 20 ml heparinisiertes Blut in ein steriles 50-ml-Röhrchen und verdünnen Sie es mit 10 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
- Pipettieren Sie 15 ml Lymphozyten-Isoliermedium in ein steriles 50-ml-Röhrchen.
Anmerkung: Lassen Sie das lymphozytenisolierende Medium vor dem Pipettieren Raumtemperatur erreichen.
- Kippen Sie den 50-ml-Schlauch mit dem Lymphozytenisolationsmedium in eine 45°-Position. Richten Sie die Spitze einer 25-ml-Pipette senkrecht aus und schichten Sie die 30 ml Blut-PBS vorsichtig auf das Lymphozytenisolationsmedium, ohne die beiden zu vermischen. Bringen Sie das 50-ml-Röhrchen ganz langsam wieder in eine vertikale Position.
- Zentrifugieren Sie bei 800 × g für 35 min bei 20 °C mit maximaler Beschleunigung und ohne Bremsen (Verzögerungsfunktion ausgeschaltet).
- Verwenden Sie eine Pasteur-Pipette, um die PBMC-Schicht (die dünne weiße Schicht direkt nach der ersten Plasmaschicht) zu sammeln und in ein neues 50-ml-Röhrchen zu übertragen.
Anmerkung: Die Dichtegradientenzentrifugation trennt Vollblut in verschiedene Schichten. Dadurch setzen sich die Erythrozyten als Pellet am Boden ab, die mononukleären Zellen (PBMCs) setzen sich an der Grenzschicht ab und das Plasma bildet die oberste Schicht. Granulozyten befinden sich zwischen dem Pellet und der PBMC-Schicht.
- Waschen Sie die geernteten PBMCs 2x, indem Sie PBS bis zu einem Volumen von 40 mL hinzufügen und durch Auf- und Abpipettieren gründlich mischen. Anschließend bei 500 × g bei 4 °C für 7 min mit maximaler Beschleunigung und maximaler Verzögerung zentrifugieren.
- Entsorgen Sie den Überstand durch Dekantieren, resuspendieren Sie das Pellet in 15 mL 1x Ammoniumchlorid-Kalium (ACK)-Puffer und inkubieren Sie es bei Raumtemperatur für 10-15 min.
Anmerkung: Nicht länger als 15 Minuten inkubieren. Der im Handel erhältliche ACK-Puffer wird verwendet, um die Lyse der verbleibenden roten Blutkörperchen (RBCs) in der PBMC-Fraktion sicherzustellen.
- PBS wird bis zu einem Volumen von 40 ml zugegeben und anschließend 7 Minuten lang bei 500 × g und 4 °C mit maximaler Beschleunigung und Verzögerung zentrifugiert.
- Den Überstand durch Dekantieren entsorgen und Schritt 1.1.9 wiederholen.
- Den Überstand verwerfen und das Pellet in 10 ml vollständigem Nährmedium (bei Raumtemperatur) resuspendieren.
Anmerkung: Das komplette Kulturmedium besteht aus RPMI 1640 Zellkulturmedium, das mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin ergänzt wird.
- Magnetische Trennung der CD14+/−-Zellen von der PBMC-Population mit CD14-konjugierten magnetischen Kügelchen
- Zählen Sie die Zellen mit einem sauberen Hämozytometer-Zellzähler unter Verwendung von 10 μl Zellsuspension, gemischt mit 10 μl Trypanblau (0,4 %) Lösung.
HINWEIS: Der Farbstoff Trypanblau ist eine giftige Chemikalie und potenziell krebserregend. Es sollte mit persönlicher Schutzausrüstung (PSA) gehandhabt werden, um Kontakt zu vermeiden, und der Abfall sollte in einem luftdichten, speziellen Behälter für giftige Abfälle entsorgt werden. Abgestorbene Zellen erscheinen blau, während lebende Zellen unter dem Mikroskop klar erscheinen.
- 7 min bei 500 × g zentrifugieren.
- Der Überstand wird mit einer Pipette verworfen und das Pellet in fluoreszenzaktiviertem Zellsortierpuffer (FACS) mit einem Volumen von 40 μl pro 1 × 107 Zellen resuspendiert. Mit einer Pipette gründlich mischen.
HINWEIS: FACS-Puffer besteht aus 2 % FBS und 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), die in PBS gelöst sind.
- 5 μl CD14-Mikrokügelchenpuffer pro 1 × 107 Zellen zugeben und mit einer Pipette gründlich mischen.
- 30 min bei 4-8 °C inkubieren, um die positive Selektion von bovinen CD14+-Monozyten zu ermöglichen. Während der Inkubationszeit alle 15 Minuten vortexen.
- Optionaler Schritt (für die durchflusszytometrische Analyse): Fügen Sie 10 μl CD14-FITC (Fluoresceinisothiocyanat)-Färbeantikörper hinzu und inkubieren Sie anschließend 15 Minuten lang bei 4-8 °C. Weitere Informationen finden Sie in der Durchflusszytometrie-Analyse in Schritt 5.
- Fügen Sie 1 ml FACS-Puffer hinzu und zentrifugieren Sie 7 Minuten lang bei 500 × g.
- Den Überstand verwerfen und das Pellet in 500 μl FACS-Puffer pro 1 ×10 8 Zellen resuspendieren.
- Setzen Sie die immunmagnetische Zelltrennsäule in den Separator (magnetischer Säulenhalter) ein und platzieren Sie ein 15-ml-Sammelröhrchen unter dem Säulenauslass zum Auffangen des Durchflusses.
- Waschen Sie die Säule mit 1 mL entgastem FACS-Puffer. Ersetzen Sie nach dem Spülen das gebrauchte 15-ml-Röhrchen durch ein neues.
- Lassen Sie die Zellsuspension (aus Schritt 1.2.8) durch die Säule laufen, indem Sie jeweils 1 × 108 Zellen in 500 μl Puffer pipettieren.
Anmerkung: Achten Sie darauf, dass beim Mischen der Zellen keine Luftblasen entstehen, bevor Sie sie durch die Säule lassen.
- Spülen Sie die Säule jedes Mal 3x mit 3 mL entgastem FACS-Puffer
.
- Sammeln Sie den Durchfluss und markieren Sie diese erste eluierte Fraktion als CD14−-Zellfraktion (PBMCs minus CD14+-Monozyten); dies wird auch als naive Lymphozytenfraktion bezeichnet.
Anmerkung: Die CD14−-Zellen werden in einem vollständigen Kulturmedium gehalten, bis antigengepulste MoDCs hergestellt werden.
- Entfernen Sie die Spalte aus dem Trennzeichen.
- Stellen Sie ein neues steriles 15-ml-Röhrchen unter die Säule, um das Abwasser aufzufangen.
- Pipettieren Sie 5 ml FACS-Puffer in die Säule und drücken Sie ihn sofort mit einem Kolben durch.
- Sammeln Sie den Durchfluss und markieren Sie diese zweite eluierte Fraktion als CD14+-Zellfraktion; dies wird auch als naive Monozytenfraktion bezeichnet.
- Geben Sie vollständiges Kulturmedium zu den geernteten CD14+-Monozyten, um 1 × 106 Zellen/ml.
zu erreichen
Anmerkung: Zählen Sie die lebenden Zellen in der eluierten CD14+-Zellfraktion, um das Volumen des gesamten Kulturmediums zu schätzen, das zum Erreichen der gewünschten Zellzahl erforderlich ist.
- Nehmen Sie eine sterile 24-Well-Platte und geben Sie 1 ml der Zellsuspension (1 × 106 Zellen/ml) in jede Vertiefung
.
- Differenzierung der CD14+ naiven Monozyten in naive MoDCs durch Zugabe von 3% w/v Zytokincocktail (GM-CSF + IL-4) mit insgesamt 5 Tagen Inkubation
- Ergänzen Sie jede Vertiefung, die CD14+-Monozyten enthält, mit 40 μl (3 % w/v) des im Kit enthaltenen Zytokincocktails.
- Die Platte wird in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2 und 37 °C 48 h lang inkubiert.
- An Tag 2 die Hälfte des Inhalts jeder Vertiefung (500 μl) mit einer Pipette in einzelne 1,5-ml-Röhrchen überführen und 7 Minuten lang bei 500 × g bei 4 °C zentrifugieren.
- Den Überstand verwerfen und das Pellet in 500 μl frischem Komplettkulturmedium resuspendieren.
- 500 μl dieser Zellsuspension aus Schritt 1.3.4 werden zurück in jede dafür vorgesehene Vertiefung übertragen, so dass das endgültige Volumen 1 ml beträgt.
- Reichern Sie jede Vertiefung mit 20 μl Zytokin-Cocktail an.
- Die Kultur wird 72 h lang in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2 und 37 °C inkubiert.
- Nach der Inkubation am 5. Tag nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator.
HINWEIS: Jede Vertiefung enthält 1 ml einer Zellsuspension von naiven MoDCs. Die Anzahl der MoDCs entspricht einem Prozentsatz (~20%) der ursprünglichen plattierten Monozyten (1 × 106/ml).
>2. Erzeugung von antigengepulsten MoDCs
HINWEIS: Ein kommerziell verfügbarer und klinisch zugelassener Impfstoff gegen das Tollwutvirus (RV) kann die Differenzierung von naiven MoDCs in reife Antigen-präsentierende MoDCs induzieren. Verwenden Sie 0,1 % (~1 μl) einer einzelnen RV-Impfdosis, um antigengepulste MoDCs zu erzeugen. Darüber hinaus wird bevorzugt, RV-gepulste MoDCs in derselben Kulturplatte herzustellen, die zur Erzeugung naiver MoDCs verwendet wird, da die Übertragung der naiven MoDCs auf eine neue 24-Well-Platte sie negativ beeinflusst.
- 1 μl/ml RV-Suspension zu 1 ml naiver MoDC-Kultur in der 24-Well-Platte geben und 48 Stunden bei 5 % CO2 und 37 °C inkubieren.
HINWEIS: Naive MoDCs, die ohne RV-Stimulation kultiviert wurden, werden als Hintergrundkontrolle verwendet (und als unspezifische Stimulation für die Co-Kultur mit Lymphozyten in den nächsten Schritten).
- Halten Sie nach der Inkubation, an Tag 7, die 24-Well-Platte mit den antigengepulsten MoDCs 10 Minuten lang auf Eis.
- Fügen Sie 1 ml eiskaltes PBS pro Vertiefung hinzu. Mischen Sie jede Vertiefung gründlich durch Pipettieren und geben Sie die Suspension in ein 15-ml-Röhrchen.
- Waschen Sie die Vertiefungen mit 2 ml eiskaltem PBS, um die in jeder Vertiefung verbleibenden Restzellen zu sammeln.
- Den Inhalt in die entsprechenden Röhrchen überführen und die Zellsuspension bei 500 × g 7 Minuten lang zentrifugieren.
- Entsorgen Sie den Überstand, resuspendieren Sie das Zellpellet (antigengepulste MoDCs) in einem vollständigen Kulturmedium und stellen Sie das Volumen auf eine endgültige Zellkonzentration von 1 × 105 Zellen/ml.
ein
Anmerkung: Zählen Sie die lebenden Zellen, um das Volumen des Mediums zu schätzen, das erforderlich ist, um die gewünschte Zellzahl zu erreichen. Verwenden Sie RV-gepulste MoDCs ab Tag 7 für das MoDC-Lymphozyten-Co-Kultursystem.
>3. MoDC-Lymphozyten-Co-Kultur
HINWEIS: Das in vitro MoDC-Lymphozyten-Co-Kultursystem bestimmt die Fähigkeit von MoDCs, antigenspezifische Lymphozyten zu primieren. Die verschiedenen Behandlungsgruppen von Zellen nach 16 Tagen Co-Kultur umfassen spezifische, unspezifische und Kontrollzellen. Die spezifische Gruppe ist definiert als Lymphozyten, die mit RV-gepulsten MoDCs kokultiviert werden; die unspezifische Gruppe ist definiert als Lymphozyten, die mit nicht-antigengepulsten MoDCs kokultiviert werden; und die Kontrollgruppe ist definiert als Lymphozyten, die ohne MoDC kultiviert wurden.
- Geben Sie das vollständige Kulturmedium zu der eluierten naiven Lymphozytenfraktion (CD14−-Zellen), um eine Zellkonzentration von 2 × 106 Zellen/ml/ml.
zu erreichen
HINWEIS: Zählen Sie die lebenden Zellen in der CD14-Zellkultur, die seit ihrer Entnahme in vollständigem Kulturmedium auf einer 24-Well-Platte aufbewahrt wurden, um das Volumen des Mediums zu schätzen, das zum Erreichen der gewünschten Zellzahl erforderlich ist.
- Nehmen Sie an Tag 7 eine sterile 24-Well-Platte und besäen Sie die Wells mit 1 ml naiver Lymphozytenzellsuspension (2 × 106 Zellen/ml) plus 1 ml antigengepulster oder nicht-antigengepulster MoDC-Suspension (1 × 105 Zellen/ml).
Anmerkung: Das Gesamtvolumen in jeder Vertiefung beträgt 2 ml mit einem Verhältnis von 1:20 MoDCs zu Lymphozyten pro Well.
- Die Platte 48 h bei 37 °C und 5 % CO2 inkubieren.
- Kulturanreicherung und Restimulation mit antigengepulsten MoDCs
- Nach der Inkubation der antigengepulsten MoDC-Lymphozyten-Cokultur an Tag 9 ergänzen Sie jede Vertiefung mit 20 ng/ml rekombinantem IL-2 und inkubieren Sie für weitere 120 Stunden (5 Tage Inkubation).
- An Tag 14 1 ml der Co-Kultur in ein steriles 1,5-ml-Röhrchen überführen und 7 Minuten lang bei 500 × g zentrifugieren.
- Den Überstand verwerfen und das Zellpellet mit 1 ml antigengepulsten oder nicht gepulsten MoDCs (1 × 105 Zellen/ml) resuspendieren. Mischen Sie vorsichtig durch Pipettieren und überführen Sie die Zellsuspensionen zurück in die dafür vorgesehenen Vertiefungen.
Anmerkung: In diesem Schritt beträgt das Gesamtvolumen in jeder Vertiefung 2 ml.
- Die Inkubation bei 5 % CO2 und 37 °C für 48 Stunden fortsetzen. Nach der Inkubation am 16. Tag ist die Co-Kultur bereit für die Analyse mittels Durchflusszytometrie, qPCR und ELISA.
Anmerkung: Von jeweils 2 ml in jeder Vertiefung der MoDC-Lymphozyten-Co-Kultur wird 1 ml resuspendierter Zellen für die Durchflusszytometrie gefärbt, 1 ml wird für die RNA-Extraktion verwendet und die Überstände von beiden werden für den ELISA verwendet.
>4. Durchflusszytometrische Analyse
HINWEIS: Färben Sie die Zellen mit geeigneten Markern/mAb, bevor Sie die Proben auf einem Durchflusszytometer laufen lassen. In der Materialtabelle finden Sie Einzelheiten zu den Reagenzien (Färbe-mAb- und Isotypkontrollen), dem Kit, dem Instrument und der Software, die für die Durchflusszytometrie-Analyse verwendet werden.
- Färbeprotokoll für Durchflusszytometer
Anmerkung: Durchführung einer Zelloberflächenfärbung für PBMCs und naive Lymphozyten und Monozyten mit Anti-CD14 mAb (Schritt 1.2.6). Für die Zelloberflächenfärbung naiver MoDCs verwenden Sie anti-CD86-spezifische, anti-CD40-spezifische und anti-MHC II-spezifische mAb. Für die Zelloberflächenfärbung von Zellen aus Co-Kulturen am Tag 16 verwenden Sie Anti-CD4-, Anti-CD8- und Anti-CD25-mAbs; Für die intrazelluläre Färbung verwenden Sie Anti-Ki-67 mAb. Des Weiteren färben Sie die Zellen entweder mit negativer Isotypkontrolle mAb oder ohne mAb (FMO: fluoreszierend minus eins). Der Hauptunterschied bei der Färbung von Oberflächen- und intrazellulären Markern besteht darin, dass bei Zelloberflächenmarkern die Zellen vor der Lebend/Tot-Färbung (L/D) oder anderen Prozessen mit spezifischem Oberflächen-mAb gefärbt werden müssen. Die intrazelluläre Färbung wird jedoch nach der L/D-Färbung durchgeführt und erfordert einen Fixierungs- und Permeabilisierungsschritt, um eine intrazelluläre Penetration zu ermöglichen.
- 1 ml Zellsuspension mit einer Pipette in ein steriles 1,5-ml-Röhrchen überführen und 10 Minuten lang bei 500 × g.
zentrifugieren
HINWEIS: Bewahren Sie nach der Zentrifugation bei der Verarbeitung der Zellen aus der MoDC-Lymphozyten-Co-Kultur den Überstand für die ELISA-Analyse auf.
- Suspendieren Sie das Pellet in 1 ml PBS und geben Sie es in ein 15-ml-Röhrchen. Sammeln Sie die Restzellen mit 1 ml PBS und kombinieren Sie dies mit dem resuspendierten Pellet.
- Geben Sie 10 ml PBS in das 15-ml-Röhrchen mit den Zellen, mischen Sie es durch Pipettieren und zentrifugieren Sie es 7 Minuten lang bei 850 x g.
- Entsorgen Sie den Überstand und wiederholen Sie Schritt 4.1.3.
- Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig mit der Restsuspension (ca. 180 μl), die nach dem Dekantieren des Überstands übrig geblieben ist.
- Übertragen Sie die Zellsuspension auf eine 96-Well-Platte mit V-Boden und versiegeln Sie die Wells, um ein Verschütten zu vermeiden.
- Die Platte bei 1.400 × g 5 min zentrifugieren. Schieben Sie die Platte nach dem Zentrifugieren über einen Abfallbehälter, um die Vertiefungen mit Flüssigkeit zu entleeren, und klopfen Sie die Platte auf saugfähiges Papier, um sicherzustellen, dass überschüssige Flüssigkeit entfernt wird.
- Fügen Sie 25 μl Mastermix für die Oberflächenfärbung pro Vertiefung hinzu und mischen Sie vorsichtig mit einer Pipette, gefolgt von einer Inkubation bei 4 °C für 30 min.
Anmerkung: Um den Mastermix für die Oberflächenfärbung für eine einzelne Vertiefung vorzubereiten, fügen Sie 2,5 μl Oberflächen-mAb zu 20 μl FACS-Puffer hinzu.
- Fügen Sie 200 μl FACS-Puffer pro Vertiefung hinzu und zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 1.400 × g. Leeren Sie nach dem Zentrifugieren die Vertiefungen mit der Flüssigkeit durch Dekantieren und klopfen Sie die Platte auf saugfähiges Papier, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.
- Geben Sie 100 μl L/D-Färbelösung pro Vertiefung hinzu. Mit einer Pipette gründlich mischen, anschließend 15 Minuten lang bei 4 °C im Dunkeln inkubieren.
Anmerkung: Lösen Sie für eine einzelne Vertiefung 0,25 μl L/D-Farbstoff in 100 μl FACS-Puffer. Der L/D-Farbstoff hilft bei der Unterscheidung zwischen lebenden und toten Zellen.
- Fügen Sie 100 μl FACS-Puffer hinzu. Decken Sie die Vertiefungen mit dem Deckel ab und zentrifugieren Sie die Platte für 1.400 × g für 5 Minuten. Entsorgen Sie den Überstand durch Dekantieren und klopfen Sie die Platte auf saugfähiges Papier.
- Wiederholen Sie Schritt 4.1.11.
- Fügen Sie 50 μl Fixierlösung pro Vertiefung hinzu (im Kit enthalten) und mischen Sie mit einer Pipette, bevor Sie die Platte 10 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.
- Fügen Sie 150 μl des mit dem Kit gelieferten 1x Permeabilization-Wash-Puffers (PW) hinzu und decken Sie die Vertiefungen mit dem Deckel ab.
Anmerkung: Zur Herstellung von 10 mL 1x PW-Puffer verdünnen Sie 1 mL 10x Perm-Puffer in 10 mL dH2O.
- Die Platte bei 1.400 × g 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Den Überstand durch Dekantieren entsorgen und auf saugfähiges Papier klopfen.
- 200 μl 1x PW zugeben, gefolgt von einer Zentrifugation bei 1.400 × g für 5 min bei 4 °C. Den Überstand durch Dekantieren entsorgen und die Platte auf saugfähiges Papier klopfen.
- Für die intrazelluläre Färbung fügen Sie 25 μl intrazelluläre Färbemastermischung (Anti-Human-Ki-67 mAb) pro Vertiefung hinzu. Gut vermischen und die Platte 30 min bei 4 °C oder auf Eis im Dunkeln inkubieren.
Anmerkung: Um den intrazellulären Färbe-Mastermix für eine einzelne Vertiefung vorzubereiten, fügen Sie 1 μl Ki-67 mAb zu 24 μl 1x PW hinzu. Der intrazelluläre Färbemarker wird nur bei der Aufbereitung von Zellen aus Co-Kulturen am Tag 16 verwendet. Die intrazelluläre Färbung wird bei der Verarbeitung von PBMCs, naiven Lymphozyten, Monozyten und naiven MoDCs nicht durchgeführt.
- Geben Sie nach der Inkubation 200 μl 1x PW in jede Vertiefung. Mit einer Pipette mischen und zentrifugieren 1.400 × g für 5 min. Entsorgen Sie den Überstand durch Dekantieren und klopfen Sie die Platte auf saugfähiges Papier.
- Fügen Sie 200 μl FACS-Puffer hinzu und zentrifugieren Sie anschließend 5 Minuten lang bei 1.400 × g. Entsorgen Sie den Überstand durch Dekantieren und klopfen Sie die Platte auf saugfähiges Papier.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet in 200 μl FACS-Puffer und übertragen Sie den Inhalt jeder Vertiefung in separate sterile Durchflusszytometerröhrchen. Verwenden Sie 300 μl FACS-Puffer pro Well, um die verbleibenden Zellen zu sammeln. Die Zellen sind nun bereit für die durchflusszytometrische Analyse.
- Durchführen der Probe auf einem Durchflusszytometer
Anmerkung: Die Proben wurden auf einem Durchflusszytometer (mit 488 nm, 638 nm und 405 nm Lasern) gemäß dem Herstellerhandbuch durchgeführt. Weitere Informationen, zur Fehlerbehebung und zur Anpassung des Protokolls finden Sie im Handbuch.
- Führen Sie vor und nach dem Ablesen der Proben routinemäßige Reinigungsvorgänge durch.
Anmerkung: Überspringen Sie keine Position, während Sie die Schläuche in das Instrument einlegen.
- Verwenden Sie für den Reinigungszyklus insgesamt vier Röhrchen, wobei das erste Röhrchen das Fließreinigungsreagenz und die restlichen drei Röhrchen dH2O enthalten; jedes Röhrchen hat 3 mL. Erfassen Sie während des Reinigungslaufs Daten mit einer mittleren Durchflussrate für ca. 1 Minute, indem Sie 100.000 Ereignisse pro Rohr unter 330 V für Vorwärtsstreuung (FSC) gegenüber 265 V für Seitenstreuung (SSC) erfassen.
Anmerkung: Während der Reinigung sollten keine Ablagerungen oder zellulären Ereignisse gemeldet werden. Führen Sie in diesem Fall den Reinigungsschritt erneut aus. Stellen Sie bei der Durchführung der Proben sicher, dass sich alle Proben in einer homogenen Suspension befinden, bevor Sie die Daten erfassen, da dies eine genaue Messung gewährleistet.
- Um das Zytometer anzuschließen und einzuschalten, klicken Sie auf die Anwendungsschaltfläche in der linken Ecke der Titelleiste. Wählen Sie im Dropdown-Menü der Anwendung die Option Zytometrie und klicken Sie auf die Option Einschalten.
Anmerkung: Über das Dropdown-Menü der Anwendung können Benutzer mit der Option Öffnen die vorprogrammierten Assays durchsuchen, während die Option Neues Protokoll es Benutzern ermöglicht, neue Protokolle zu erstellen.
- Laden Sie zunächst die negative Kontrollprobe in den Mehrfachröhrchenhalter. Wählen Sie Neues Protokoll und beobachten Sie die Arbeitsliste auf der linken Seite des Arbeitsbereichs/Bildschirms.
- Definieren Sie in der Arbeitsliste die Position der Probe im Mehrröhrchenhalter und geben Sie der Probe einen Namen und ein Protokoll zur Identifizierung ein.
- Über das Hardware-Bedienfeld auf der linken Seite des Arbeitsbereichs können Sie mehrere Parameter anpassen und auswählen, z. B. die Detektoren (FSC, SSC und 10 Fluoreszenzbereiche), die Spannungen (V) und Verstärkungen der Photomultiplier sowie die Fläche-Höhe-Breite (AHW) des Signals.
Anmerkung: Basierend auf dem verwendeten Experiment und Instrument wurden folgende Einstellungen für die Detektoren gewählt: FSC-AHW: AHW, V: 270, G: 5; SSC-AHW: A, V: 350, G: 10; FL1 (CD8/FITC Dextran)-AHW: A, V: 400, G: 1; FL2 (CD25/PE)-AHW: A, V: 500, G: 1; FL6 (CD4/Alexa Fluor 647)-AHW: A, V: 700, G: 1; FL7 (Ki-67/Alexa Fluor 700)-AHW: A, V: 625, G: 1; FL9 (L/D)-AHW: A, V: 425, G: 1.
- Passen Sie in der Systemsteuerung für die Geräteerfassung unter der Titelleiste die Optionen für die Durchflussrate (mittel), die Zeit (5 min) und die Ereignisse (siehe Schritt 5.2.8) an, die erkannt werden sollen. Klicken Sie auf die Option Acquire Single, um dem Gerät das Zeichnen/Ausführen des Samples zu ermöglichen und die Echtzeitvorschau der erkannten Ereignisse anzuzeigen.
- Passen Sie in der Echtzeitvorschau den Schwellenwert für die Fluoreszenz (Spannung und Verstärkung) und die Zellgröße an, um schließlich Gates um die gewünschte Zellpopulation zu zeichnen, während zelluläre Trümmer ausgeschlossen werden.
Anmerkung: Die Kolzov-Platte hilft bei der Unterscheidung von Zellen anhand ihrer Größe und ermöglicht so die Unterscheidung zwischen Zellen des Immunsystems wie Monozyten und Lymphozyten. Monozyten sind größer und weisen im Vergleich zu Lymphozyten eine höhere FSC-Intensität auf.
- Erfassen Sie insgesamt etwa 5.000 lebende MoDCs, 50.000 lebende Lymphozyten und 50.000 lebende Monozytenereignisse.
- Sobald alle Parameter in Bezug auf die Negativkontrollprobe angepasst sind, klicken Sie auf Stopp und speichern Sie das Protokoll.
- Laden Sie nun alle Proben auf den Multi-Tube-Loader. Definieren Sie jede Probe im Arbeitsvorrat und wenden Sie die Parameter, die in Bezug auf die Negativkontrolle angepasst wurden, auf alle Proben innerhalb des Experiments an. Klicken Sie auf die Option Erfassen, um alle Proben des Experiments nacheinander ausführen zu können.
- Sobald die Daten aller Proben erfasst sind, können Sie sie speichern und mit einer geeigneten Datenanalysesoftware, die die Erstellung von sequentiellen biparametrischen und monoparametrischen Histogrammen ermöglicht, in lesbare Daten umwandeln.