Ein Hämozytenstörungstest zur Beurteilung der Readhäsion von Hämozyten an hämatopoetische Taschen

Zusammenfassung

Quelle: Petraki, S. et al., Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva.J. Vis. Exp.(2015)

Dieses Video zeigt den Hämozytenstörungstest, der die erneute Adhäsion von Hämozyten in den hämatopoetischen Taschen von Drosophila-Larven bewertet. Mechanische Störungen setzen residente Hämozyten frei, wodurch die Anzahl der zirkulierenden Hämozyten erhöht wird. Nach der Genesung wird die erneute Adhärenz der residenten Hämozyten bestätigt, was die Reversibilität verdeutlicht.

Protokoll

>1. Hämozyt-Blutungs-/Kratz-Assay

1. Vorbereitung der Objektträger:
   1. Option 1 für Mikroskope ohne Kachelscanfunktion: Für jede zu analysierende Larve wird ein Objektträger mit ca. 5 Pap-Pen-Vertiefungen à 2 mm im Quadrat entsprechend dem Feldbetrachtungsbereich des Mikroskops vorbereitet; jeweils ca. 5 - 10 μl S2-Medium zugegeben (Abbildung 1A). Bewahren Sie die Objektträger in einer feuchten Kammer auf, um ein Austrocknen der Vertiefungen zu verhindern.
   2. Option 2 für Mikroskope mit Kachelscanfunktion: Für jede zu analysierende Larve wird ein Objektträger mit 3 bis 4 Pap-Pen-Vertiefungen von jeweils ~3 - 4 mm Quadraten vorbereitet; in jede Vertiefung werden ca. 15 - 20 μl S2-Medien gegeben (Abbildung 1B). Bewahren Sie die Objektträger in einer feuchten Kammer auf, um ein Austrocknen der Vertiefungen zu verhindern.
      Anmerkung: Die oben empfohlene Anzahl von Vertiefungen ist ausreichend für eine Gesamtmenge von bis zu 3.000 Hämozyten pro Larve (Larven im späten 2^{. Stadium,} ~2,5 - 3 mm Länge, Transgenmarkierung für den Großteil der Larvenblutzellen). Bei der Beurteilung einer größeren Anzahl von Blutzellen sind möglicherweise mehr Vertiefungen erforderlich, um eine Überfüllung zu vermeiden.
2. Sammlung von Larven:
   1. Spritzen Sie Wasser in ein Fliegenfläschchen mit Larven und spülen Sie die Larven in eine Petrischale, oder schöpfen Sie etwas Futter, das Larven enthält, in eine Petrischale und verdünnen Sie es mit einer Spritzflasche mit Wasser.
   2. Entnehmen Sie die Larven vorsichtig mit einem Pinsel aus der Petrischale und legen Sie sie in Wasser in eine Hohlraumschale oder auf einen Objektträger auf einem kalten Block.
      Anmerkung: Die Larven können für eine begrenzte Zeit im Wasser oder auf einem kalten Block gehalten werden; Verwenden Sie die Proben innerhalb von 45 Minuten oder weniger, um den Tod der Larven oder unerwünschte Auswirkungen auf die Hämozyten zu vermeiden.
3. Dissektion:
   1. Selektieren Sie die Larven unter einem Fluoreszenzmikroskop auf einem kalten Metallblock. Messen Sie die Größe und bilden Sie bei Bedarf Larven ab.
   2. Isolierung zirkulierender Hämozyten ("Bleed"):
      1. Sobald die Larven ausgewählt sind, legen Sie eine Larve in die erste Vertiefung des Pap-Pens (Abbildung 1C, 2A).
      2. Verwenden Sie 2 saubere Nadeln oder eine Präparierschere und eine Pinzette, um sowohl am hinteren als auch am vorderen Ende der Larve einen Schnitt zu machen. Um die ansässigen Hämozyten nicht zu stören, ist es am besten, diese Schnitte auf der ventralen Seite der Larve vorzunehmen. Um konsistente Ergebnisse zu erzielen, machen Sie die Schnitte für jede Larve an den gleichen Stellen. Für Larven des 1^. Stadiums ist 1 Schnitt (im ventralen Frontzahnbereich) ausreichend.
      3. Lassen Sie die Larve einige Sekunden lang ohne Druck oder körperliche Bewegung bluten (Abbildung 2A).
         Anmerkung: Wenn Sie an mehreren Larven arbeiten, ist es besser, diese Schnitte für jede einzelne zu machen, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren, um zu vermeiden, dass die Larven zu lange auf Eis gehalten werden, da dies die Integrität der Proben beeinträchtigen könnte.
      4. Heben Sie die Larve vorsichtig mit den Nadeln oder der Pinzette an und tauchen Sie sie in die zweite Vertiefung, um alle verbleibenden zirkulierenden Hämozyten zu spülen. Danach folgen Sie mit der Freisetzung der residenten Hämozyten.
   3. Isolierung von residenten Hämozyten ("Scrape"):
      1. Setzen Sie die Larve vorsichtig in die nächste Vertiefung um (Abbildung 2C).
      2. Identifizieren Sie die Lymphdrüse der Larve, die sich typischerweise etwa 1/3 vom vorderen Ende der Larve entfernt befindet und dorsal durch die Körperwand der Larve fluoreszieren kann. Vermeiden Sie die Lymphdrüse, während Sie die ansässigen Hämozyten freisetzen, indem Sie die Larve mit einer Nadel so nah wie möglich an der Lymphdrüse festnageln, um eine Punktion zu vermeiden (Abbildung 2C).
         Anmerkung: Während der normalen Entwicklung ist die Reifung der Lymphdrüsen-Hämozyten im Vergleich zu larvalen Hämozyten verzögert, und fluoreszierende Reporter differenzierter Hämozyten zeigen möglicherweise kein Signal in den Lymphdrüsen junger Larven. In diesen Fällen muss der Lymphdrüse weniger Aufmerksamkeit geschenkt werden, da keine Kontamination von differenzierten fluoreszenzmarkierten Larven-Hämozyten durch Lymphdrüsen-Hämozyten zu erwarten ist.
      3. Setzen Sie residente Blutzellen in einem Präparierprozess des Schabens und/oder Stechens frei. Verwenden Sie eine Nadelspitze, um die Larve in der Nähe der Lymphdrüse (siehe oben) oder anderer Körperbereiche nach Bedarf effektiv festzunageln. Mit einer anderen Nadel stechen Sie in die Hämozytencluster, die durch die Körperwand der Larve sichtbar sind (Abbildung 2C, E), mit dem Ziel, die Hämozyten zu trennen. Hämozyten können auch in einer Schabebewegung freigesetzt werden. Ein frühzeitiges Reißen der Epidermis kann jedoch dazu führen, dass große Ansammlungen von Blutzellen freigesetzt werden, was die automatisierte Zählung erschweren könnte.
         Anmerkung: Je nach Alter und Genotyp der Larve variiert die Anzahl der Gesamthämozyten. Verteilen Sie den oben beschriebenen Freisetzungsprozess auf mehrere Wells, um eine Überfüllung einiger Wells mit Blutzellen zu vermeiden, die die Einzelzellbildanalyse erschweren könnte.
      4. Wenn nur noch wenige Hämozyten im endgültigen Schlachtkörper verbleiben, zählen Sie diese Hämozyten durch Beobachtung durch das Mikroskop und mit einem manuellen Zählzähler (Abbildung 2E). Um das Zählen zu erleichtern, legen Sie den Schlachtkörper auf eine saubere Stelle desselben Objektträgers und verteilen Sie ihn so dünn wie möglich, um die Anzahl der optischen Ebenen zu reduzieren.
      5. Sobald die Dissektion abgeschlossen ist, warten Sie zwischen 5 und 10 Minuten, bis sich die Zellen abgesetzt haben (aber nicht unbedingt haften), bevor Sie die Vertiefungen abbilden. Inkubieren Sie den Objektträger in einer feuchten Kammer, um ein Austrocknen zu vermeiden und eine grobe Handhabung der Objektträger zu vermeiden, die die abgesetzten Hämozyten stören könnte.
         Anmerkung: Bei der Bestimmung der Hämozytenzahl werden freigesetzte Zellen nicht fixiert und die Zellen müssen kurz nach der Dissektion, vorzugsweise innerhalb von 30 Minuten nach der Freisetzung aus der Larve, abgebildet werden. Abhängig vom Volumen des Mediums und den Zelleigenschaften hat sich die überwiegende Mehrheit der Zellen innerhalb von 5 - 10 Minuten abgesetzt, was durch Fokussierung durch die optischen Ebenen des Mediums in der Vertiefung bestätigt werden sollte. Zu diesem Zeitpunkt wird jedoch nur ein Bruchteil der Blutzellen an der Objektträgeroberfläche haftet haben, eine Tatsache, die berücksichtigt werden muss, wenn dieses Protokoll für zellfixierungsbasierte Ansätze modifiziert wird.
4. Quantifizierung:
   1. Nehmen Sie Bilder der abgesetzten Hämozyten unter einem Fluoreszenzmikroskop auf (Abbildung 2B, D, F). Anschließend erfolgt die Quantifizierung der Hämozyten mit der ImageJ-Software.
   2. Bereiten Sie das Bild für den ImageJ-Zellzählalgorithmus vor:
      1. Öffnen Sie das Bild des Bohrlochs mit ImageJ: Datei → Öffnen Sie → (Datei suchen und auswählen).
      2. Stellen Sie sicher, dass die Bilder 8-Bit oder 16-Bit sind. Passen Sie den Schwellenwert für das Bild an, indem Sie Bild auswählen, dann auf Anpassen klicken und Schwellenwert auswählen. Beachten Sie das "Schwellenwertfenster" (Abbildung 3A).
      3. Aktivieren Sie die Option "Dunkler Hintergrund". Wählen Sie "Rot" und erhöhen Sie den unteren Schwellenwert (siehe schwarzer Pfeil), bis jede Zelle im Bild mit einem roten Punkt markiert ist (Zellen, die nicht abgedeckt werden, werden in Graustufen angezeigt; Abbildung 3B). Wenn der untere Schwellenwert erhöht wird, werden einige Zellen nicht mehr markiert. Dies kann der Indikator dafür sein, wie weit der untere Schwellenwert gesetzt werden soll.
         Anmerkung: Gelegentlich kann es vorkommen, dass Zellcluster nicht aufgelöst werden können und vom Partikelzähler als eine Einheit gezählt werden. In solchen Fällen kann die Anzahl der Zellen in einem Cluster geschätzt werden, indem das Bild untersucht (bei Bedarf vergrößert wird) und die manuelle Zählung mit einem Zählzähler durchgeführt wird. Alternativ kann der untere Schwellenwert erhöht werden, um Zellcluster aufzulösen. Alle nicht markierten Zellen, die aus dieser Manipulation resultieren, können dann mit einem Zählzähler gezählt werden.
   3. Analysieren Sie die Zellzahl mit ImageJ:
      1. Starten Sie den Partikelanalysator, um die Zellen zu zählen (Abbildung 3C). Wählen Sie "Analysieren" und klicken Sie auf "Partikel analysieren". Wählen Sie optional "Konturen überlagern", um die Partikel zu sehen, die der Algorithmus zählt (Abbildung 3D). Alternativ können Sie die Größe oder den Pixelbereich einer Einheit (z. B. Zelle, Zellklumpen usw.) begrenzen, damit der Algorithmus zählen kann.
      2. Klicken Sie auf OK. Beobachten Sie ein Zusammenfassungsfenster mit der Anzahl (Abbildung 3E).

>2. Hämozytenstörungs-Assay

1. Um die Hämozyten zu stören, wählen Sie Larven aus und legen Sie sie in ein 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit ca. 0,5 g Glasperlen (212 - 600 μm) und fügen Sie 0,5 ml Wasser hinzu.
2. Wirbeln Sie das Rohr mit der Hand bei Geschwindigkeit 10 für 1 min ein.
3. Hole die Larven aus den Glasperlen, indem du den Inhalt des Mikrozentrifugenröhrchens in eine Petrischale gibst und die Larven mit einem Pinsel herausnimmst.
4. Für die Erholungsphase legen Sie die Larven in zuvor vorbereitete Petrischalen mit kleinen Mengen Fliegenfutter. Lassen Sie die Larven ihr Hämozytenmuster für einen Zeitraum von 45 Minuten oder wie gewünscht wiederherstellen.
   Anmerkung: Entsorgen Sie alle Larven, die sich nicht mehr bewegen, da sie dabei abgestorben sind. In der Regel sehen wir jedoch nach 1 Minute Vortexen nur geringe Schäden.
5. Fahren Sie nach der Erholungsphase mit dem Blutungs-/Kratztest fort, wie oben in Abschnitt 1 beschrieben.

Ergebnisse

Abbildung 1. Aufbau und Schema des Hämozyte Bleed/Scrape and Disturbance Assays. (ein)Single Image Slide Setup: fünf 2-mm-Quadrate für die Bildgebung mit einem 5-fach-Objektiv. (B) Tile Scan Slide Setup: vier 3-mm-Quadrate für die Bildgebung von Blutungen/Kratzern von ≤2,5 mm Larven mit einem Kachelscan-Mikroskop. Empfohlene Objektive für die Bildgebung sind 5X oder 10X. (...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
6cm/9cm Petrischalen			Eine für jeden zu evaluierenden Genotyp
Wasserspritzer-Flasche
Löffel/Pfannenwender aus Metall
Dünner Pinsel			z.B. ein "Liner"
Hohlraumschale aus Glas
PAP-Stift: Super PAP PEN IM3580	Beckman Coulter
Objektträger aus Glas			Auf jeder Folie sind 5 oder mehr PAP-Stift-Quadrate gezeichnet. Die Größe der Quadrate hängt vom Abbildungsobjektiv und der Vergrößerung der Mikroskopkamera ab. z.B. 2mm Quadrate.
Feuchte Kammer			Dies wird verwendet, um das Austrocknen von Rutschen und Vertiefungen zu verhindern: versiegelter Behälter mit nassen Papiertüchern an den Seiten/Boden
Drosophila-Zellkulturmedien von Schneider	Invitrogen
Kalter Block			Dabei handelt es sich um einen Metallblock (auch Heizblock genannt), der in einem Eimer mit Eis gekühlt wird; vorzugsweise schwarz oder in einer anderen dunklen, nicht reflektierenden Farbe
Zwei 1ml Spritzen mit Nadeln (27G 1/2)	Becton Dickinson		Zum Sezieren.
Optional: Chirurgische Federschere (Schneide 2mm)	Werkzeuge für die Feinwissenschaft
Glasperlen, 212-600 Mikron	Sigma
2 ml Eppendorf Röhrchen	Eppendorf		Einer pro Genotyp bei der Auswertung
Vortex-Mischer	Fisher Scientific
Transgene Drosophila-Larven mit fluoreszenzmarkierten Hämozyten. Geeignete Transgene umfassen: HmlΔ-DsRed (Makhijani et al., 2011), MSNF9mo-mCherry (Tokusumi et al., 2009), BcF6-CFP und -GFP (Gajewski et al., 2007) oder HmlΔ-GAL4 (Sinenko und Mathey-Prevot, 2004), Pxn-GAL4 (Stramer et al., 2005), He-GAL4 (Zettervall et al., 2004), Crq-GAL4 (von H. Agaisse et al., 2005)) oder eater-GAL4 (Tokusumi et al., 2009) kombiniert mit UAS-GFP oder anderen fluoreszierenden Proteintransgenen.
Fluoreszenz-Präpariermikroskop	Leica		Hier: Leica M205, optional mit Kamera, Imaging-Software und Messmodul
Inverses Fluoreszenzmikroskop mit Kamerabefestigung	Leica oder Keyence		Mit oder ohne Kachelscanfunktion (z. Leica DMI-Serie, Keyence BIOREVO BZ-9000 Serie)