Eine Peptid-MHC-I-Tetramer-Färbetechnik zur Analyse von SIV-spezifischen CD8+-Gedächtnis-T-Zellen

Zusammenfassung

Quelle: Gonzalez-Nieto, L., et al. Analyse von Simian Immunodeficiency Virus-spezifischen CD8⁺ T-Zellen bei Rhesusaffen durch Peptid-MHC-I-Tetramerfärbung. J. Vis. Exp. (2016)

Dieses Video demonstriert eine Methode zur Charakterisierung von CD8⁺-Gedächtnis-T-Zellen, die spezifisch für das Affenimmundefizienzvirus (SIV) sind, unter Verwendung von Peptid-Haupthistokompatibilitätskomplex Klasse I (pMHC-I) Tetrameren. Ein pMHC-I-Tetramer ist ein Komplex aus vier MHC-I-Molekülen, die an SIV-spezifische Peptide gebunden und an ein Fluorophor konjugiert sind. Diese Tetramere binden selektiv an T-Zell-Rezeptoren (TCRs) auf SIV-spezifischen CD8⁺ T-Zellen, was die Charakterisierung dieser Zellen erleichtert.

Protokoll

>1. PKI-Behandlung

HINWEIS: Dies ist optional, wird aber für Mamu-B*017:01 Tetramere empfohlen.

1. Resuspendieren Sie PBMC in R10-Medium in einer Konzentration von 1,6 x 10⁷ Zellen/ml.
2. Geben Sie 50 μl dieser Zellsuspension in die entsprechenden Durchflusszytometrie-Röhrchen. Geben Sie 50 μl einer 100 nM PKI-Lösung in jedes Röhrchen.
3. Wirbeln Sie jedes Rohr ein. Bei 37 °C 30 min inkubieren. Am Ende dieses Schritts sollte jedes Röhrchen 100 μl einer Zellsuspension enthalten, die 8,0 x 10⁵ PBMC und 50 nM PKI enthält.
4. Fahren Sie mit dem Schritt zum Färben des pMHC-I-Tetramers fort.

>2. Färben mit Fluorochrom-markierten pMHC-I-Tetrameren

1. Vor der Zubereitung des pMHC-I Tetramer-Mastermixes zentrifugieren Sie die pMHC-I Tetramerröhrchen bei 20.000 x g für mindestens 15 min bei 4 °C. Das Ziel dieses Schritts ist es, Proteinaggregate in der pMHC-I-Tetramerlösung zu pelletieren, die die Hintergrundfärbung erhöhen können. Vermeiden Sie nach Abschluss des Zentrifugationsschritts das Pipettieren vom Boden des Röhrchens, wo sich die Proteinaggregate angesammelt haben.
2. Bereiten Sie genügend pMHC-I-Tetramer-Mastermix vor, um alle Versuchsröhrchen zu färben. Bereiten Sie einen Überschuss von 15 % des Gesamtvolumens dieses Mastermixes vor, um Pipettierfehler auszugleichen.
3. Verdünnen Sie pMHC-I-Tetramere in Fleckenpuffer (z. B. Brilliant Stain Buffer), so dass jedem Test 25 μl des pMHC-I-Tetramer-Mastermixes zugesetzt werden.
   1. PBMC wird mit zwei pMHC-I-Tetrameren pro Test markiert, von denen eines an Allophycocyanin (APC) und das andere an Brilliant Violet (BV) 421 konjugiert ist.
4. 8,0 x 10⁵ PBMC werden in den entsprechenden Durchflusszytometrie-Röhrchen mit einem Endvolumen von 100 μl zugegeben. Wenn die Zellen der oben beschriebenen PKI-Behandlung unterzogen wurden, sollten sie bereits in diesem Schritt in 100 μl resuspendiert werden.
5. Geben Sie 25 μl pMHC-I-Tetramer-Mastermix in die entsprechenden Durchflusszytometrie-Röhrchen. Am Ende dieses Schritts sollte das endgültige Volumen in jedem Röhrchen 125 μl betragen.
6. Jedes Röhrchen vortexen, um die Zellsuspension zu homogenisieren.
7. 45 Minuten lang im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubieren. Bereiten Sie während dieser 45-minütigen Inkubation den oberflächenfärbenden monoklonalen Antikörper (mAb) Cocktail vor.

>3. Oberflächenfärbung

1. Bereiten Sie genügend mAb-Mastermix vor, um alle experimentellen Röhrchen zu färben. Bereiten Sie einen Überschuss von 15 % des Gesamtvolumens dieses Mastermixes vor, um Pipettierfehler auszugleichen.
2. Passen Sie das Volumen des Mastermixes mit Fleckenpuffer so an, dass 50 μl pro Test hinzugefügt werden.
3. Für den korrekten Ausschluss von Nicht-CD8⁺-T-Zellen und die Abgrenzung von Gedächtnisuntergruppen verwenden Sie titrierte Mengen an mAbs, die gegen die folgenden Moleküle im Mastermix für die Oberflächenfärbung gerichtet sind.
   Anmerkung: Die Fluorochrome, die an jeden mAbs konjugiert sind, werden als Referenz angegeben: CD14 BV 510, CD16 BV 510, CD20 BV 510, CD8α BV 785, CD28 PE Cy7 und CCR7 FITC. Beachten Sie, dass die mAbs gegen CD14, CD16 und CD20 an dasselbe Fluorochrom (d.h. BV 510) konjugiert sind, da sie im "Dump"-Gate enthalten sind.
4. Fügen Sie einen fixierbaren Farbstoff zur Unterscheidung toter Zellen in den Mastermix für die Oberflächenfärbung hinzu [d. h. aminreaktiver Farbstoff (ARD)]. Stellen Sie sicher, dass das ARD-Reagenz an ein Fluorochrom mit einem ähnlichen Emissionsspektrum konjugiert ist, wie es im "Dump"-Gate verwendet wird. Nutzen Sie in diesem Fall ARD Aqua.
5. 50 μl des in 3.1-3.4 beschriebenen Färbe-Mastermixes werden in die entsprechenden Durchflusszytometrie-Röhrchen gegeben. Am Ende dieses Schritts sollte das endgültige Volumen in jedem Röhrchen 175 μl betragen.
6. Wirbeln Sie jedes Rohr ein. Im Dunkeln bei Raumtemperatur 25 min inkubieren.
7. Waschzellen mit Waschpuffer (phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)) mit 0,1 % Rinderserumalbumin und 0,45 g/l NaN3).
   Vorsicht: Natriumazid (NaN₃) ist eine giftige Substanz. Die Exposition gegenüber selbst winzigen Mengen kann Symptome verursachen. Behandeln Sie diesen Stoff gemäß den Richtlinien, die vom Amt für Umwelt, Gesundheit und Sicherheit (EHS) der Einrichtung festgelegt wurden, in der diese Experimente durchgeführt werden.
8. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 510 x g für 5 min. Überstand vorsichtig in einen separaten Abfallbehälter umfüllen. Achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören.
   Vorsicht: Waschpufferüberstand nicht in bleichmittelhaltige Behälter umfüllen, da dieser mit dem im Waschpuffer vorhandenen Natriumazid reagieren und zur Bildung eines giftigen Gases führen kann. Wenden Sie sich an das EHS-Büro der Einrichtung, in der diese Experimente durchgeführt werden, um Richtlinien zur Entsorgung von Natriumazid zu erhalten.
9. Nach dem Dekantieren die Zellen in der in jedem Röhrchen zurückgehaltenen Flüssigkeit vortexen.

>4. Zellfixierung

1. Geben Sie 250 μl einer 2%igen Paraformaldehyd (PFA)-Lösung in alle Röhrchen, um die Zellen zu fixieren.
   ACHTUNG: PFA ist eine giftige Substanz. Die Exposition gegenüber selbst winzigen Mengen kann Symptome verursachen. Behandeln Sie diesen Stoff gemäß den Richtlinien, die vom EHS-Büro der Einrichtung festgelegt wurden, in der diese Experimente durchgeführt werden.
   1. Da die 2%ige PFA-Lösung für die Zellen isotonisch sein muss, verwenden Sie PBS, um diese Lösung herzustellen. Einhundert Milliliter einer 2%igen PFA-Lösung reichen für mehrere Experimente. Alle Röhrchen sofort nach der Zugabe von 2% PFA gründlich vortexen, um die Bildung von Zellaggregaten zu verhindern.
2. Im Dunkeln bei 4 °C für 20 min inkubieren.
3. Waschen Sie die Zellen, indem Sie die Schritte 3.7-3.9 wiederholen. Sobald dieser Schritt abgeschlossen ist, können die Zellen im Dunkeln bei 4 °C für 24-48 Stunden gelagert werden. Bevor Sie mit der Permeabilisierungsphase fortfahren, wirbeln Sie die Röhren gründlich ein.

>5. Permeabilisierung von Zellen

1. 500 μl Permeabilisierungspuffer zugeben. Wirbeln Sie alle Rohre ein.
2. Im Dunkeln bei Raumtemperatur 10 min inkubieren.
3. Waschen Sie die Zellen, indem Sie die Schritte 3.7-3.9 wiederholen.

>6. Intrazelluläre Färbung

1. Bereiten Sie genügend mAb-Mastermix vor, um alle experimentellen Röhrchen zu färben.
2. Passen Sie das Volumen mit PBS oder Färbepuffer so an, dass pro Test 50 μl des intrazellulären mAb-Mastermixes hinzugefügt werden.
3. Bereiten Sie den in 6.1 und 6.2 beschriebenen mAb-Mastermix mit titrierten mAbs-Mengen vor, die gegen CD3 und Granzym B (Gzm B) gerichtet sind.
   Anmerkung: Die TCR-Bindung durch pMHC-I-Tetramere kann zu einer CD3-Internalisierung führen, die den Nachweis von Tetrameren + CD3⁺ CD8⁺ T-Zellen beeinträchtigen kann, wenn das Anti-CD3-mAb zum Mastermix für die Oberflächenfärbung hinzugefügt wird. Um dies zu vermeiden, fügen Sie den Anti-CD3-mAb in diesem Stadium hinzu, d. h. nachdem die Zellen permeabilisiert wurden. Die Fluorochrome, die an jeden mAb konjugiert sind, sind als Referenz aufgeführt: CD3, PerCP, Cy5.5 und Gzm, B, PE.
4. Geben Sie 50 μl mAb-Cocktail in die entsprechenden Röhrchen. Im Dunkeln bei Raumtemperatur 30 min inkubieren.
5. Waschen Sie die Zellen, indem Sie die Schritte 3.7-3.9 wiederholen. Die Röhrchen können in einem Durchflusszytometer entnommen werden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Dasatinib	Axon medchem	Axon 1392	Muss in DMSO resuspendiert und sofort bei -20°C gelagert werden
RPMI mit Glutamax	gibco/ Lebenstechnologien	Artikel-Nr.: 61870-036	Muss bei 4 °C gelagert werden
Hitzeinaktiviertes FBS	gibco/ Lebenstechnologien	Nr. 10082-147	Muss bei 4 °C gelagert werden
Penicillin-Streptomycinp-Amphotericin B	Lonza	17-745E	Muss bei 4 °C gelagert werden
DMSO, wasserfrei	Lebenstechnologien	Nr. D12345	Bei Raumtemperatur lagern.
5-ml-Röhrchen aus Polypropylen mit rundem Boden	VWR	Tel.: 60819-728
Fluorochrom-konjugierte pMHC-I-Tetramere	NIH Tetramer Core oder MBL, Inc.		Muss bei 4 °C gelagert und aufbewahrt werden. Vor Gebrauch 15 Minuten lang bei 20.000 x g zentrifugieren. Nicht einfrieren.
Fluorochrom-konjugierte mAbs	Verschiedene Unternehmen		Muss bei 4 °C gelagert und aufbewahrt werden. Nicht einfrieren.
LIVE/DEAD Fixierbares Aqua Dead Cell Stain Kit	Lebenstechnologien	Nr. L34957	Muss bei -20 °C gelagert werden. Jedes Aliquot wird vor der Verwendung in 50 μl DMSO resuspendiert.
Brillanter Fleckenpuffer	BD Biowissenschaften	563794	Muss bei 4 °C gelagert werden
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	VWR	Artikel-Nr.: 97064-158	Bei Raumtemperatur lagern
Albumin Rind	VWR	Artikel-Nr.: 700011-230	Muss bei 4 °C gelagert werden
Natriumazid	VWR	Artikel-Nr.: 97064-646	Bei Raumtemperatur lagern. Giftstoff. Nicht mit Bleichmittel mischen.
Bleichmittel	VWR	Tel.: 89501-620	Korrosive Chemikalie, kann nicht mit Natriumazid gemischt werden. Mit Vorsicht behandeln
Paraformaldehyd	Elektronenmikroskopie	15714-S	Entflammbares, ätzendes und giftiges Reagenz. Mit Vorsicht behandeln
Polysorbat 20 (Tween-20)	Alfa Aesar	Nr. L15029	Bei Raumtemperatur lagern
Permeabilisierung Lösung 2	BD Biowissenschaften	340973	Giftiges und ätzendes Reagenz. Mit Vorsicht behandeln
Sarsdet Tuben 1,5 ml Schraubverschluss	VWR	Artikel-Nr.: 72.692.005
2,0 ml DNA/RNA Röhrchen mit geringer Bindung	Eppendorf	22431048	Die Verwendung von sterilen Mikroröhrchen wird bevorzugt
Vortex-Mischer
Biosicherheitswerkbank
Milli Q Intergral Wasseraufbereitungssystem	EMD Millipore	ZRXQ010WW	Es kann Wasser in molekularbiologischer Qualität von jedem Anbieter verwendet werden
Mikrozentrifuge
Zentrifuge
4 °C Kühlschrank
BD LSR II	BD Biowissenschaften		Das Durchflusszytometer muss Laser und Filter enthalten, die mit dem verwendeten Färbepanel kompatibel sind.
Deionisiertes Wasser
Alufolie	VWR SCIENTIFIC INC.	Artikel-Nr.: 89068-738
Brutkasten			Muss in der Lage sein, eine Innentemperatur von 37 °C zu halten
FACS Diva Software	BD Biowissenschaften
Flowjo Software Version 9.6	Flowjo		Wird verwendet, um FCS-Dateien zu analysieren, die von der FACS Diva-Software generiert wurden
Micropippette-Spitzen