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>1. Fluoreszenzmarkierung und Perfusion von Leukozyten (PMN oder THP-1 für humane und RAW264.7 oder primäre Mausmonozyten für murine flussbasierte Assays)
- Fluoreszierende Markierung
- Markieren Sie die Leukozyten (1 x 106/ml) mit der zellpermeierten grün fluoreszierenden Nukleinsäurefärbung (1 μM). Inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang bei 37 °C.
- Waschen Sie die Zellen mit PBS durch Zentrifugation bei 300 x g für 5 min und suspendieren Sie die Zellen auf eine Konzentration von 0,5 x 106 Zellen/ml (5 mL pro Testbedingung, abhängig von der Flussrate) in Assay-Puffer
.
- Vorbereitung von Durchflusskammer-Assays
- Für die Leukozytenadhäsion auf einer Zellmonoschicht entsorgen Sie das Zellkulturmedium aus der Schale und bauen es in die Durchflusskammer ein. Verbinden Sie den Schlauch mit der Spritze. Für die Leukozytenadhäsion auf immobilisierten Blutplättchen verbinden Sie den Mikroobjektträger mit der Spritze. Ein Wasserbad auf 37 °C vorwärmen.
- Nehmen Sie eine Perfusionsspritze (50 ml), setzen Sie die Spritze auf den Spritzenhalter und stellen Sie die Pumpe auf den Entnahmemodus. Stellen Sie das Pumpenvolumen auf 0 ml und den Durchmesser auf 26,70 mm für die 50-ml-Spritze ein.
- Verbinden Sie einen Winkel-Luer-Anschluss mit einem Ende des Schlauchs. Setzen Sie eine Luer-Lock-Kupplung auf die Spritze und verbinden Sie den Schlauch mit dem Winkel-Luer-Anschluss mit der Luer-Lock-Kupplung. Verbinden Sie das freie Schlauchende mit der Durchflusskammer.
- Leukozytenperfusion und -adhäsion
- Für die Leukozytenadhäsion auf einer Zellmonoschicht entsorgen Sie das Zellkulturmedium aus der Schale und bauen es in die Durchflusskammer ein. Verbinden Sie den Schlauch mit der Spritze. Für die Leukozytenadhäsion auf immobilisierten Blutplättchen verbinden Sie den Mikroobjektträger mit der Spritze.
- Für die Perfusion und Adhäsion von Leukozyten über einer Gefäß- oder Thrombozyten-Monoschicht legen Sie den zweiten Schlauch in ein konisches 50-ml-Röhrchen mit Assay-Puffer und füllen Sie den Schlauch mit 1 ml-Pipette, drücken Sie dann den Schlauch zusammen und verbinden Sie ihn mit einer Durchflusskammer.
- Vor der Leukozytenperfusion 3 mM CaCl2 und 2 mM MgCl2 zur Zellsuspension geben und 5 min bei 37 °C inkubieren.
- Perfusion des Assay-Puffers vor der Perfusion der Zellen, um mögliche Luft aus der Kammer und den Schläuchen zu entfernen.
- Verschließen Sie die Röhrchenenden, indem Sie sie fest zusammendrücken und den Schlauch von Assay-Puffer auf Zellsuspension umstellen, um zu verhindern, dass Luftblasen eingeschlossen werden. Perfundierte Zellen mit entsprechender Flussrate/Scherspannung, bis die ersten Zellen eintreffen.
- Perfundierte Zellen mit entsprechender Flussrate/Scherspannung für 2 Minuten und Aufnahme von mindestens 6 Bildern zwischen 2 und 6 Minuten von rollenden und adhärenten Zellen mit einem inversen Phasenkontrast-/Fluoreszenzmikroskop (z. B. EVOS-FL) unter Verwendung einer 100-fachen Vergrößerung, die an eine digitale CCD- oder CMOS-Kamera angeschlossen ist
HINWEIS: Die Durchflussmenge/Scherspannung hängt von den Abmessungen der Durchflusskammer und der Viskosität des Perfusats ab. Für die hier verwendete Perfusionskammer (siehe Materialtabelle):
τ=η*97,1*Φ
τ: Schubspannung (1 dyn/cm2)
η: Viskosität (0,015 dyn*s/cm2)
Φ: Durchflussrate (0,67 mL/min)
- Deadhäsion von Leukozyten
- Um die Adhäsion zu lösen, wechseln Sie den Schlauch von der Zellsuspension zum Assay-Puffer, indem Sie den Schlauch zusammendrücken, um zu verhindern, dass Luftblasen eingeschlossen werden.
- Die Zellen werden durch Perfusion mit einem Assay-Puffer mit geeigneter Flussrate/Scherspannung abgelöst (siehe 3.3.7 Anmerkung).
- Transmigration von Leukozyten
- Für die Leukozytentransmigration perfundieren Sie die Leukozyten (Schritt 3), bis eine ausreichende Menge an Leukozyten haftet (~50 Zellen/Sichtfeld).
- Ersetzen Sie die Leukozytensuspension durch einen Assay-Puffer.
- Erfassen Sie transmigrierende Zellen im Zeitraffer alle 10–15 s für 30–60 min bei 37 °C.