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>1. Herstellung von Nanostrukturen
- Wählen Sie Glasdeckgläser mit einem Durchmesser von 25 mm und einer Dicke von ca. 170 μm (Nr. 1,5) als Substrate für die Nanofabrikation.
- Tauchen Sie die Deckgläser mindestens 6 Stunden lang in Piranha-Lösung (3:1-Verhältnis von Schwefelsäure und Wasserstoffperoxid). Waschen Sie das in Piranhas getränkte Deckglas mit reichlich ultrareinem 18,2 MΩ deionisiertem destilliertem Wasser (DDW).
Vorsicht: Piranhasäure reagiert heftig mit organischen Stoffen und muss mit äußerster Vorsicht behandelt werden.
- 10 nm Chrom-Dünnschicht durch Elektronenstrahlverdampfung auf die Deckgläser aufbringen, um Ladungseffekte bei der Strukturierung und Abbildung von Nanostrukturen zu vermeiden.
- Die erste Schicht des Doppelschicht-Resists, bestehend aus Ethyllactatmethylmethacrylat (MMA_EL6)-Copolymer, wird 45 Sekunden lang bei 2.000 U/min geschleudert und anschließend bei 150 °C gebacken. Die zweite Schicht Polymethylmethacrylat (950PMMA_A2) wird 45 Sekunden lang bei 3.000 U/min geschleudert und anschließend bei 180 °C gebacken.
- Strukturierung des Doppelschicht-Resists mittels Elektronenstrahllithographie (EBL) bei 25 kV mit einer Flächendosis von 300 μC/cm2. In Isopropylalkohol (IPA)/Methylisobutylketon (MIBK): 2/1 entwickeln und in IPA spülen.
- Ti (5 nm) / Au (80 nm) Film mit einem Elektronenstrahlverdampfer auf dem Substrat abscheiden.
- Heben Sie nach der Goldabscheidung den Copolymer-Doppelschichtlack ab, indem Sie das Substrat 4 Stunden lang in Aceton einweichen.
- Untersuchen Sie das Substrat mit dem Rasterelektronenmikroskop (REM), um die Form und Größe der Nanostruktur zu bestätigen, entfernen Sie das restliche Chrom vom Substrat durch Nassätzen mit CR-7-Ätzmittel für 60 Sekunden bei RT und spülen Sie es dann in DDW ab.
- Entwerfen Sie einen Array-Abstand von 33 μm von Mitte zu Mitte, um Platz für die Zellbildgebung zwischen den Arrays zu lassen. Strukturieren Sie die Nanostrukturen in einem 20 x 20 Muster für jedes Array mit einem Abstand von 300 nm mit einem Elektronenstrahlschreiber. Jeder Chip enthält 300 Arrays mit einer typischen Nanostrukturabmessung von 80±2,5 nm Höhe und 70±2,5 nm Durchmesser.
- Untersuchen Sie eine Teilmenge von Arrays mit dem Rasterkraftmikroskop (Rasterkraftmikroskop) zur Überprüfung von Größe und Gleichmäßigkeit.
- Befestigen Sie einen Stützring, in der Regel Silikon, mit einem UV-härtenden Epoxidharz an der Rückseite des Deckglases.
>2. Chipreinigung und Auftragen von selbstorganisierten Monolayern
- Zur Reinigung und Regeneration der Späne Plasmaasche mit einer Leistung von 40 W in einem 300 mTorr-Gemisch aus 5 % Wasserstoff und 95 % Argon für 45 Sekunden, nachdem die Kammer 5 Minuten lang unter den gleichen Bedingungen gereinigt wurde.
- Funktionalisieren Sie die Goldnanostrukturen unmittelbar nach der Plasmaveraschung, indem der Chip in eine Zweikomponenten-ethanolische Thiollösung getaucht wird, die aus einem 3:1-Verhältnis von SH-(CH2)8-EG,3-OH (SPO) und einer Komponente mit entweder einer Amin- oder Carboxyl-Funktionsgruppe, nämlich SH-(CH2)11-EG, 3-NH2 (SPN) oder SH-(CH2)11-EG 3-COOH (SPC), besteht.
- Lassen Sie den Chip in der Thiollösung O/N, um eine selbstorganisierte Monoschicht (SAM) zu bilden.
- Spülen Sie den Chip mit Ethanol ab und trocknen Sie ihn mit Stickstoffgas ab.
- Lagern Sie den funktionalisierten Chip bei Bedarf bis zu 2 Wochen bei 4 °C.
- Wenn sie gebrauchsfertig ist, reagieren sie die SPN- oder SPC-Komponente mit dem Liganden mit einer Chemie, die vom Liganden der Wahl abhängt (siehe unten).
Anmerkung: Die Chips können dutzende Male regeneriert und refunktionalisiert werden. Ein bestimmter Chip kann für Zeiträume von 6 Monaten bis zu über einem Jahr verwendet werden. Die auf einem gegebenen Array gemessenen Spektren werden nach wiederholter Regeneration durch Plasmaveraschung und anschließender Biofunktionalisierung zuverlässig reproduziert.
>3. Oberflächenfunktionalisierung und kinetische Charakterisierung
Hinweis: Verwenden Sie den funktionalisierten Chip im kommerziellen SPR-Instrument, um die kinetischen Geschwindigkeitskonstanten zwischen dem Liganden und dem Analyten zu charakterisieren, sowie um die Resistenz von SAM gegen unspezifische Bindung zu untersuchen. Es gibt eine breite Palette von Durchflussraten und mikrofluidischen Designs, die eine effiziente Oberflächenfunktionalisierung ermöglichen. Da wir eine kommerziell erhältliche SPR haben, haben wir die empfohlenen Durchflussraten standardisiert. Wir stellen fest, dass diese Flussraten typisch für alle SPR-Instrumente sind und daher nicht restriktiv sind. Das SPR-Instrument ist keine Notwendigkeit, da alle Funktionalisierungen direkt auf dem lokalisierten Oberflächenplasmonenresonanzbild-Chip (LSPR) durchgeführt werden können, aber es hat unsere Arbeitsbelastung reduziert, da es sich um ein Multiplex-Instrument handelt, während unser LSPR-Mikrofluidik-Aufbau dies nicht ist.
- Funktionalisieren Sie einen kommerziellen Bare-Gold-Chip mit dem SAM, wie in Abschnitt 2 beschrieben.
- Bei Verwendung eines SPC-basierten SAM aktivieren Sie die Carboxylgruppe mit einer 1:1-Mischung aus 133 mM 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC) und 33 mM N-Hydroxysuccinimid (NHS) in DDW für 10 min.
- Konjugieren Sie die aktivierte Carboxylgruppe mit dem interessierenden Antikörper/Liganden für 300 Sekunden bei einer Flussrate von 30 μl/min. Bereiten Sie die Liganden in der Regel in pH-6-Phosphatpuffer vor, dies kann jedoch je nach Molekül variieren.
- Nach der Ligandenkonjugation fließen 0,1 M Ethanolamin in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) als Deaktivatorschritt für 300 sec mit einer Geschwindigkeit von 30 μl/min. Ethanolamin hilft bei der Minimierung der unspezifischen Bindung.
- Führen Sie den interessierenden Analyten mit einer Flussrate von 100 μl/min unter Verwendung eines Konzentrationsbereichs ein und berechnen Sie die kinetischen Geschwindigkeitskonstanten mit Hilfe einer kinetischen Analysesoftware.
- Wenn eine unspezifische Bindung problematisch ist, erhöhen Sie das Verhältnis von SPO zu SPC oder SPN.
>4. Allgemeine LSPR-Einstellungen
- Mikroskop-Einstellungen:
- Verwenden Sie eine 100 W Halogenlampe, um die Probe von Köhler zu beleuchten. Verwenden Sie einen Langpassfilter (typischerweise 593 nm Cutoff) im Strahlengang, um Wellenlängen zu eliminieren, die nicht zur Resonanzverschiebung beitragen (Abbildung 1).
- Verwenden Sie für die LSPRi-Datenerfassung ein inverses Mikroskop mit einem 40-fachen Ölimmersionsobjektiv (1,4 NA) und einer thermoelektrisch gekühlten 16-Bit-CCD-Kamera.
- Platzieren Sie einen Strahlteiler am Ausgangsanschluss des Mikroskops, um Bilder und Spektren gleichzeitig zu erhalten.
- Stellen Sie den temperierten Mikroskoptisch auf 37 °C ein und äquilibrieren Sie ihn 4 Stunden lang.
- Integrieren Sie eine zusätzliche Inkubationsanordnung in das Mikroskop, um die CO2 -Konzentration und die Luftfeuchtigkeit auf 5 % bzw. 95 % zu regulieren.
- Spanvorbereitung und -montage:
- Funktionalisieren Sie den LSPR-Chip, wie in Abschnitt 2 beschrieben, mit den optimalen Zwei-8-Komponenten-SAM-Verhältnissen, die aus den SPR-Experimenten bestimmt wurden.
- Laden Sie den Chip wie folgt in einen speziell angefertigten mikrofluidischen Halter. Platzieren Sie den Chip auf einem Aluminium-Unterteil. Stecken Sie den Chip zwischen dieses untere Teil und eine Silikondichtung und ein oberes Stück aus durchsichtigem Kunststoff. Verwenden Sie 4 Schrauben, um die Baugruppe zu klemmen.
- Für eine typische SPC-basierte Thiolanwendung wird eine 1:1-Mischung aus 133 mM EDC und 33 mM NHS mit 300 μl in DDW tropfen lassen, um die Carboxylgruppen der SPC-Thiolkomponente zu aktivieren.
- Warten Sie 10 Minuten und spülen Sie die Oberfläche manuell mit 10 mM PBS ab.
- Konjugieren Sie die aktivierte Carboxylgruppe mit dem interessierenden Liganden (typischerweise ein Antikörper oder ein Antikörperfragment) durch Tropfenbeschichtung von 300 μl Ligandenlösung.
- Warten Sie 30 Minuten und spülen Sie manuell mit 10 mM PBS aus.
- 300 μl 0,1 M Ethanolamin in PBS auf den Chip tropfen lassen, um unspezifische Bindungen zu minimieren. Warten Sie 10 Minuten.
- Waschen Sie das Ethanolamin mit PBS mit 0,005 % Tween 20 (PBS-T20).
- Platzieren Sie ein Quarzstück über dem Chip, um Schwankungen in den Daten im Zusammenhang mit einem sich verändernden Meniskus zu reduzieren.
- Halten Sie den Chip mit PBS-T20-Puffer feucht, während Sie ihn auf das Mikroskop montieren.
- Setzen Sie die LSPR-Chip-Baugruppe fest in den Probenhalter für den beheizten Tisch ein und befestigen Sie den mikrofluidischen Schlauch.
- Befestigen Sie den Mikrofluidikschlauch an der Baugruppe und dem Durchflusspuffer (oder serumfreien Medien für Zellstudien), bis ein stationärer Zustand erreicht ist.
- Lassen Sie die Baugruppe und das Mikroskop mindestens 2 Stunden lang äquilibrieren.
- Richten Sie den Chip mit einem Joystick so aus, dass das zentrale Array mit der Faseroptik für die Spektroskopie ausgerichtet ist. Die spektroskopischen Daten werden mit einem Spektrometer und einer Spektralanalysesoftware erfasst.
- Halten Sie die Arrays während des gesamten Experiments im Fokus, indem Sie den Software-Autofokus, Zeiss Definite Focus oder ein gleichwertiges Autofokusgerät verwenden.
>5. LSPR-Bildgebung von Anti-c-myc-Sekreten aus 9E10-Hybridomzellen
Hinweis: Die für diese Studie verwendete Hybridom-Zelllinie exprimiert konstitutiv Anti-c-Myc-Antikörper und benötigt daher keinen chemischen Auslöser
- Funktionalisieren Sie die Nanostrukturen mit c-myc-Peptid. Dieser hat einen KD-Wert von 1,77 nM für die Anti-c-Myc-Antikörper, die von klonierten 9E10-Hybridomzellen sezerniert werden.
- Die Hybridomzellen werden in einem vollständigen Wachstumsmedium mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) und 1 % Antibiotikum in einem T75-Kolben bei 37 °C unter 5 % CO2 kultiviert. Halten Sie eine Zelldichte von 4 ×105 Zellen/ml aufrecht.
- Für die Zellsekretionsstudien werden Pelletzellen aus dem T75-Kolben durch Zentrifugation zweimal mit RPMI-1640 serumfreiem Medium (SFM) gewaschen, um die sezernierten Antikörper zu entfernen und die Zelldichte auf 4 ×106 Zellen/ml einzustellen.
- Ernten Sie die Zellen und testen Sie sie auf Lebensfähigkeit, bevor Sie sie auf die LSPR-Chips aufbringen.
- Geben Sie 50 μl der Zelllösung manuell mit einer Mikropipette auf die LSPR-Chips. Nach einigen Minuten haften 25 bis 50 Zellen an der Oberfläche der LSPR-Chips.
- Waschen Sie die verbleibenden Zellen in Lösung mit frischem SFM unter Verwendung des mikrofluidischen Perfusionssystems ab.
- Wählen Sie die LSPR-Arrays für die Bildgebung aus, die nahe beieinander liegen, innerhalb von 10 μm, aber nicht mit den Zellen überlappen.
- Um sicherzustellen, dass das Signal spezifisch für die sezernierten Anti-c-myc-Antikörper ist, führen Sie die Zellkulturmedien mit und ohne vorhandene Antikörper sowie mit den Antikörpern ein, deren Bindungsstellen jedoch durch das Vorhandensein einer Sättigungskonzentration des c-myc-Peptids in der Lösung blockiert sind.
- Kalibrieren Sie die Sensoren am Ende jedes Laufs mit einer Sättigungslösung aus Anti-c-myc-Antikörpern (250 nM). Dies hilft bei der Normalisierung der Reaktion der Sensoren und der Bestimmung der fraktionierten Belegung basierend auf dem Biofunktionalisierungsprofil jedes Laufs.
- Korrigieren Sie die Drift in X- und Y-Richtung mit Hilfe der Bildausrichtungssoftware.
