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>1. Virus-Titration
HINWEIS: Abhängig von der Anzahl der Viren und der Anzahl der Duplikate kann eine Well-Platte mit den folgenden Flexibilitäten eingerichtet werden: (1) Die Virusverdünnung kann entweder entlang der Zeilen oder der Spalten angeordnet werden (Abbildung 1). Jeder Virus sollte eine separate Zeile/Spalte belegen. (2) Das Inkrement der Virusverdünnung ist flexibel, sollte aber mit der höchsten Viruskonzentration in der oberen linken Ecke beginnen. (3) Es gibt keine Begrenzung der Anzahl der Duplikate.
- Aliquotieren Sie ausreichend MDCK-Zellen oder MDCK-SIAT-Zellen8 in 96-Well-Platten (200 μl/Well). Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C mit 5 % CO2 für 2 oder 3 Tage, um die Konfluenz zu erreichen. Vermehren Sie die Zellen in DMEM, ergänzt mit 10 % hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum (FCS) und Antibiotika (100 E/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin). Inkubieren Sie die SIAT-Zellen bei 37 °C mit 5 % CO2 und 1 mg/ml G418 Sulfat.
Anmerkung: Der Verdünnungsfaktor ist abhängig von der Erfahrung und der verwendeten Zelllinie. Die Zellmonoschicht muss zum Zeitpunkt der Virusinokulation konfluent sein (d. h. keine Zellwand oder sichtbarer Umriss für MDCK-Zellen und ein dicht gepacktes Layout für MDCK-SIAT1-Zellen). Beispiele für Verdünnungen auf der Grundlage der Subkultur konfluenter Kolben von MDCK- oder MDCK-SIAT1-Zellen sind in Tabelle 1 aufgeführt.
- Waschen Sie die Zellen 3 Mal mit 200 μl Viruswachstumsmedium (VGM) pro Vertiefung. Sterilisieren Sie die mehrwandige Plattenwaschmaschine 30 Minuten lang mit 70 % EtOH und spülen Sie sie dann vor dem Waschen in steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) oder VGM aus.
- Aspirieren Sie das VGM und geben Sie sofort 50 μl VGM in jede Vertiefung
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- Geben Sie 900 μl VGM in jedes der 6 sterilen Röhrchen (oder weniger, abhängig von der Anzahl der Testviren und Duplikate). Pipettieren Sie 100 μl Virus in das erste Röhrchen, mischen Sie es gut und verdünnen Sie es seriell, wobei Sie die Spitzen zwischen jeder Verdünnung wechseln. Wiederholen Sie den Vorgang für jedes Virus, das titriert werden soll.
Anmerkung: Dies führt zu Virusverdünnungen von 10-1 bis 10-6.
- Geben Sie 50 μl jeder Virusverdünnung, beginnend bei der höchsten Verdünnung (1 x 10-5 in Abbildung 1), in duplizierte Vertiefungen (Spalten 9 und 10 in Abbildung 1) einer 96-Well-Platte.
- Stellen Sie die Platte 2-3 Stunden lang bei 37 °C auf, damit das Virus die Zellen infizieren kann.
Anmerkung: Eine 2- bis 3-stündige Inkubation ist notwendig, um sicherzustellen, dass die Viren im Inokulum genügend Zeit haben, die Monoschicht zu erreichen.
- Bereiten Sie das Overlay vor (10 ml/Platte)
Anmerkung: Das Overlay besteht aus 5 ml 2x DMEM, Trypsin (2 μg/ml Endkonzentration), 20 μl 1 mg/ml Stamm und 5 ml Cellulose-Baumwoll-Linters (siehe Materialliste).
- Entfernen Sie das Inokulum.
- Fügen Sie das Overlay hinzu (200 μl in jede Vertiefung). Über Nacht bei 37 °C inkubieren, UNGESTÖRT.
Anmerkung: Die Virusknospung findet nach ca. 4 Stunden statt, daher ist es wichtig, dass die Platte nach dieser Zeit nicht gestört wird.
- Saugen Sie die Überlagerung aus den Vertiefungen an.
- Fügen Sie eiskaltes 4%iges Paraformaldehyd in PBS A (200 μl/Well) hinzu. Stellen Sie sie 30 min lang bei 4 °C oder 20 min bei Raumtemperatur auf
HINWEIS: PBS A ist eine phosphatgepufferte Kochsalzlösung mit natürlichem pH-Wert und enthält 10 g NaCl, 0,25 g KCl, 1,437 g Na2HPO4, 0,25 g KH2PO4 und 1 l destilliertes Wasser (siehe Materialliste).
HINWEIS: Paraformaldehyd ist schädlich, wenn es eingeatmet wird, und kann beim Verschlucken Verbrennungen verursachen. Es gibt auch nur begrenzte Hinweise auf eine krebserregende Wirkung, die nach Hautkontakt zu einer Sensibilisierung führen kann.
- Aspirieren Sie das Paraformaldehyd und waschen Sie die Platten zweimal mit PBS A (200 μl/Well).
- Lagern Sie die Platten für die zukünftige Verwendung in PBS A bei 4 °C oder fahren Sie mit den folgenden Schritten fort.
- Permeabilisierungspuffer (100 μl/Well) zugeben. Lassen Sie es 30 Minuten bei Raumtemperatur.
- Waschen Sie die Platte zweimal mit PBS A (200 μl/Well).
- Geben Sie 50 μl des ersten Antikörpers, Maus-MAb gegen Influenza Typ A (1:1.000 in ELISA-Puffer), pro Vertiefung. Inkubieren Sie es 1 Stunde lang bei Raumtemperatur (oder 4 °C über Nacht) unter Schütteln.
- Waschen Sie es 3 Mal in 100 μl Waschpuffer (0,05 % Tween 80 in PBS A, v/v) pro Vertiefung. Inkubieren Sie es zwischen den Wäschen 5 Minuten lang bei Raumtemperatur. Alternativ 3 Mal ohne Inkubation mit 300 μl pro Vertiefung waschen.
- Geben Sie 50 μl des zweiten Antikörpers, eines Ziegen-Anti-Maus-IgG (H+L) HRP-Konjugats (1:1.000 in ELISA-Puffer), pro Vertiefung hinzu. Inkubieren Sie es 1 Stunde lang bei Raumtemperatur unter Schütteln.
- Waschen Sie es 3 Mal wie in Schritt 1.17 beschrieben.
- Fügen Sie das Substrat (50 μl/Well) hinzu. Inkubieren Sie es bei Raumtemperatur für 30 Minuten oder bis die Entwicklung einer blauen Farbe deutlich sichtbar ist.
- Um die Reaktion zu stoppen, waschen Sie die Platte zweimal mit 200 μl destilliertem Wasser pro Vertiefung und inkubieren Sie sie zwischen den Waschgängen 2 -3 Minuten lang bei Raumtemperatur.
- Trocknen Sie die Platte an der Luft und lagern Sie sie an einem dunklen Ort (z. B. wickeln Sie sie in Alufolie ein).
2. Virus-Neutralisierung
HINWEIS: Berechnen Sie die Anzahl der für den Neutralisationsassay erforderlichen Platten. Jede Platte kann ein Virus und eine Reihe von Antiseren aufnehmen.
HINWEIS: Abhängig von der Anzahl der Antiseren und der Anzahl der Duplikate kann eine Well-Platte mit den folgenden Flexibilitäten eingerichtet werden: (1) Die Serumverdünnung kann entweder entlang einer Reihe oder einer Säule angeordnet werden (Abbildung 2). Jedes Serum sollte eine separate Zeile oder Spalte einnehmen. (2) Das Inkrement der Serumverdünnung ist flexibel, sollte aber mit der höchsten Serumkonzentration in der oberen linken Ecke einer Platte beginnen. (3) Die Zahl der Duplikate gleicht die Zahl der Antisera aus. Mehr Duplikate können helfen, experimentelle Variationen auszugleichen. (4) Die Anzahl der VC und die Anzahl der Cell Control (CC)-Duplikate sind flexibel, sollten aber auch in separaten Zeilen oder Spalten stehen. Es wird erwartet, dass die Anzahl der VC-Duplikate deutlich größer ist als die der Antiseren.
- Bereiten Sie die Zellmonoschicht wie in den Schritten 1.1-1.3 2 oder 3 Tage im Voraus vor.
- Geben Sie 50 μl VGM in jede Vertiefung der Platte.
- Verwenden Sie die Spalten 11 und 12 für VC bzw. CC. Geben Sie 50 μl Aliquots von 1:20 Rezeptor-zerstörendem Enzym (RDE)-behandeltem Serum in die erste Reihe (A) der Spalten 1-10.
Anmerkung: Für jede Virus-Serum-Kombination wird der Assay in doppelter Ausführung durchgeführt, so dass eine Platte beispielsweise ein Virus enthalten kann, das gegen fünf Antiseren getestet wurde.
Führen - Sie 2-fache serielle Verdünnungen durch, indem Sie 50 μl von Reihe A in Reihe H (Spalten 1-10 in Abbildung 2) übertragen und 50 μl aus Reihe H verwerfen.
- Geben Sie 50 μl Verdünnungsmittel in jede Vertiefung der CC-Säule (Spalte 12 in Abbildung 2).
- Geben Sie 50 μl des Virus in jede Vertiefung der Platte, mit Ausnahme der CC-Säule (Spalten 1-11, Zeilen A-H in Abbildung 2).
- Inkubieren Sie es bei 37 °C für 2-3 Stunden. Entfernen Sie das Inokulum. Geben Sie das Overlay (200 μl) in jede Vertiefung. Inkubieren Sie es über Nacht bei 37 °C ungestört. Fixieren und färben Sie die Platten wie für die Virustitration (Schritte 1.11-1.22).
>3. Quantifizierung der Neutralisation
- Platzieren Sie eine Well-Platte im Scanbereich eines Flachbettscanners, wie in Abbildung 2a dargestellt. Verwenden Sie die L-förmige Positionsgrenze, um eine optimale und wiederholbare Bildgebungsposition zu gewährleisten.
Anmerkung: Es ist möglich, zwei Well-Platten in einem Scan abzubilden.
- Scannen Sie die Platte.
- Führen Sie die Software "Wellplate Reader" aus, um die erforderlichen Virustiter zu berechnen (Abbildung 3).
- Klicken Sie auf die Schaltfläche "Bild laden", um ein Bild zu laden. Schieben Sie den roten Balken in "Globaler Schwellenwert", um den Sampling-Schwellenwert anzupassen. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Aktualisieren", um den Effekt zu untersuchen.
- Aktivieren Sie das Kontrollkästchen "Neutralisation/Titration berechnen". Klicken Sie auf die Schaltfläche "Stichprobe", um den ICP zu quantifizieren. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Speichern", um die Probenahmeergebnisse zu speichern, wenn Sie dazu aufgefordert werden.
Anmerkung: Nach dem Probenahmevorgang erscheint automatisch ein neues Fenster mit dem Namen "Neutralisation & Titrationsberechnung", wenn das Kästchen "Neutralisation/Titration berechnen" aktiviert ist.
- Laden Sie die Well-Plate-Map, oder geben Sie sie ein. Geben Sie den Schwellenwert (z. B. 50 %) unter "Neutralisierung: Infektionsabzug (%)" an.
- Wählen Sie "Neutralisationsprozess", um die Titer zu berechnen. Überprüfen Sie die Titer und klicken Sie auf die Schaltfläche "Speichern & Schließen", um die Neutralisationsergebnisse zu speichern.
Anmerkung: Die Neutralisation wird als Kehrwert der höchsten Verdünnung des Serums mit der vordefinierten ICP-Reduktion (z. B. 50 % oder 80 %) gegenüber der VC (dem Mittelwert von Spalte 11 in Abbildung 4) angegeben. In den repräsentativen Ergebnissen wurde eine ICP-Reduktion von 50 % verwendet.
