Quantifizierung der autophagischen Sequestrierungsaktivität in Säugetierzellen

Zusammenfassung

Quelle: Luhr, M. et al., Der Laktat-Dehydrogenase-Sequestrierungsassay — Eine einfache und zuverlässige Methode zur Bestimmung der autophagischen Sequestrierungsaktivität in Säugetierzellen. J. vis. exp. (2018)

Das Video zeigt einen Assay zur Beurteilung der autophagischen Sequestrierungsaktivität in Säugetierzellen. Es nutzt die Elektroporation, um zytosolische Proteine, einschließlich der Laktatdehydrogenase (LDH), freizusetzen. Die sequestrierten LDH- und die gesamtzellulären LDH-Fraktionen werden bestimmt, um die LDH-Sequestrierung zu beurteilen und geben Einblicke in die Gesamtaktivität der Massensequestrierung.

Protokoll

>1. Zellaussaat und -behandlung

1. Kultivieren Sie adhärente Zellen in 75 cm² Gewebekulturkolben in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO₂ bei 37 °C unter Verwendung des bevorzugten Kulturmediums für den betreffenden Zelltyp. Lassen Sie die Zellen wachsen, bis sie eine nahezu konfluente Zellschicht erreichen.
   Anmerkung: Verwenden Sie das Medium 1640 des Roswell Park Memorial Institute (RPMI), das mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) für LNCaP, HEK293, embryonale Fibroblasten (MEFs) der Maus, BJ-, MCF-7- und RPE-1-Zellen ergänzt wurde.
   1. Waschen Sie die Zellen mit 3 mL 37 °C phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4. Ersetzen Sie das PBS durch 3 mL 0,25 % (w/v) Trypsin-Ethylendiamintetraacetat (EDTA) und inkubieren Sie den Kolben in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO₂ bei 37 °C, bis sich die Zellen ablösen (2–5 min).
   2. Resuspendieren Sie die abgelösten Zellen mit einem 7-ml-Kulturmedium mit 10 % FBS. Mischen Sie ein 10-μl-Zellsuspensionsaliquot mit 10 μl 0,4 % Trypanblau in einem Mikrozentrifugenröhrchen mit einer 0,5–20 μl-Pipettenspitze. Verwenden Sie dieselbe Pipettenspitze, um einen Objektträger der Zählkammer sofort zu füllen, und zählen Sie die Zellen in einem automatisierten Zellzähler.
2. Bereiten Sie eine geeignete Verdünnung (siehe Anmerkung unten) der Zellsuspension aus Schritt 1.1.2 unter Verwendung eines Kulturmediums mit 10 % FBS vor und säen Sie 1 ml der verdünnten Zellsuspension in jeder Vertiefung einer 12-Well-Gewebekulturplatte (Oberfläche ~3,8 cm²) unter Verwendung einer aseptischen Technik. Lassen Sie das Wachstum in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO₂ bei 37 °C wachsen, bis die gewünschte Zelldichte erreicht ist, z. B. 60–90 % Konfluenz bei der Ernte.
   Anmerkung: Die geeignete Verdünnung der Zellsuspension, die bei der Ernte die gewünschte Zellkonfluenz ergibt, variiert von Zelltyp zu Zelltyp sowie je nach Dauer und Art der experimentellen Behandlungen. Dies muss also in jedem Einzelfall empirisch bewertet werden.
   1. Für Experimente, die 2 Tage nach der Aussaat sowohl behandelt als auch geerntet werden sollen, säen Sie 2,5 x 10⁵ LNCaP-, HEK293- oder MCF-7-Zellen, 5 x 10⁴ MEFs, 4 x 10⁵ BJ oder 1,5 x 10⁵ RPE-1-Zellen in jede Vertiefung der 12-Well-Platte.
   2. Bei Zellen, die locker haften, beschichten Sie die Platten mit der für den jeweiligen Zelltyp empfohlenen Beschichtungsart. Für LNCaP- (und HEK293-) Zellen werden Platten verwendet, die mit Poly-D-Lysin (PDL) beschichtet sind.
   3. Geben Sie zu diesem Zweck 500 μl PDL mit 2,5 μg/ml in sterilem H₂O in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platten in einer sterilen Umgebung für 30 Minuten bei Raumtemperatur (20–25 °C). Entfernen Sie die PDL mit Absaugung und waschen Sie jede Vertiefung kurz mit 1 mL sterilem H₂O.
      Anmerkung: In der Regel wird Schritt 1.2.1 ohne experimentelle Behandlungen durchgeführt. Bei der Durchführung von RNAi kann es jedoch sinnvoll sein, eine umgekehrte Transfektion mit der Aussaat zu starten.
3. Führen Sie experimentelle Behandlungen in doppelten oder dreifachen Vertiefungen pro Bedingung durch.
   1. Behandeln Sie die Zellen beispielsweise mit 50 nM des mTOR-Inhibitors Torin1, der im Allgemeinen ein effizienter Induktor der autophagischen Sequestrierung ist, oder setzen Sie die Zellen einem akuten Serum- und Aminosäuremangel aus, indem Sie die Zellen mit 1 ml aminosäurefreiem EBSS-Medium (Earle's Balanced Salt Solution) waschen und anschließend die Zellen in 1 ml EBSS in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % Kohlendioxid (CO₂) bei 37 °C inkubieren.
   2. Lassen Sie einen Satz Wells unbehandelt, um die Hintergrundwerte der sedimentierbaren Laktatdehydrogenase (LDH) zu definieren.
   3. Geben Sie eine sättigende Menge des Postsequestrierungsinhibitors Bafilomycin A1 (Baf) in Abwesenheit oder Gegenwart der experimentellen Behandlungen 3–4 Stunden vor der Zellentnahme zu. Inkubieren Sie die Zellen in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO₂ bei 37 °C.
      1. Verwenden Sie 100 nM Baf für LNCaP-, HEK293-, BJ-, MCF-7- und RPE-1-Zellen und 10 nM Baf für MEFs.
      2. Bei experimentellen Behandlungen, die nur 3-4 Stunden dauern (wie die in Schritt 1.3.1 gezeigten), fügen Sie Baf gleichzeitig mit den Behandlungen hinzu. Warten Sie für längere experimentelle Behandlungen bis 3-4 h vor der Ernte und geben Sie 2 μl einer 500x konzentrierten Baf-Brühe direkt in das Medium.
      3. Mischen, indem die Platte unmittelbar nach der Zugabe von Baf umgerührt wird. Zu diesem Zeitpunkt ist es auch empfehlenswert, makroautophagische Sequestrierungsinhibitoren als Kontrollen hinzuzufügen, z. B. 10 mM des Pan-Phosphoinositid 3-Kinase (PI3K)-Inhibitors 3-Methyladenin (3MA) oder 10 μM des selektiven PI3K-Klasse-III-Inhibitors SAR-405.

>2. Zellernte und Vorbereitung für die Elektrodisruption

1. Am Ende der Behandlungsphase wird das Medium mit Absaugung abgesaugt und 200 μl Zellablösungslösung (auf 37 °C vorgewärmt) in jede Vertiefung gegeben. Bei 37 °C inkubieren, bis sich die Zellen ablösen (in der Regel ca. 5 min).
   Anmerkung: Während 0,25 % (w/v) Trypsin-EDTA anstelle der Zellablösungslösung verwendet werden können, enthält letztere DNase, die dazu beiträgt, die Viskosität der abgelösten Zellen zu reduzieren. Solange das Medium gründlich aspiriert wird, ist es nicht notwendig, die Zellen vor der Zugabe von Trypsin-EDTA oder Zellablösungslösung zu waschen.
2. 500 μl PBS bei Raumtemperatur (20-25 °C) pH 7,4 mit 2 % (w/v) Rinderserumalbumin (BSA) in jede Vertiefung geben und mit der Pipette resuspendieren, bis keine Zellklumpen mehr sichtbar sind. Übertragen Sie die Zellsuspension sofort in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis.
   Anmerkung: Wenn nicht anders angegeben, führen Sie alle nachfolgenden Schritte auf Eis durch.
3. Sedimentieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 400 x g für 5 min bei 4 °C.
4. Saugen Sie den Überstand gründlich an (mit Absaugung), um die Zellpellets so trocken wie möglich zu halten.
5. Geben Sie 400 μL 10 % (w/v) Saccharose (in ultrareinem H₂O) in jedes Röhrchen.

>3. Plasmamembran-Elektrodisruption und Trennung von sedimentierbaren und totalen Zellfraktionen

1. Das Küvettenpellet wird mit einer Pipette resuspendiert, um eine einzellige Suspension zu erhalten, und in eine 4-mm-Elektroporationsküvette überführt.
   Anmerkung: Ein Auf- und Abpipettieren von ~10 bis 15 Mal mit einer Pipettenspitze von 100 bis 1.000 μl ist in der Regel ausreichend.
2. Legen Sie die Küvette in einen Exponentialabklingwellen-Elektroporator und entladen Sie einen einzelnen elektrischen Impuls bei 800 V, 25 μF und 400 Ω; diese Einstellungen erzeugen einen Impuls von ~8 ms Dauer.
3. Verwenden Sie eine neue Pipettenspitze, um den Zellaufschluss in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen zu übertragen, das 400 μl eiskalte, phosphatgepufferte Saccharoselösung (100 mM Natriummonophosphat, 2 mM Dithiothreitol (DTT), 2 mM EDTA und 1,75 % Saccharose, pH 7,5) enthält, und mischen Sie kurz durch Pipettieren.
   1. Optional: Um einen effizienten Elektroaufschluss der Plasmamembran zu überprüfen, mischen Sie 10 μl des verdünnten Zellaufschlusses aus Schritt 3.3 mit 10 μl 0,4 % Trypanblau in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. In eine Zählkammer geben und überprüfen, ob der Prozentsatz der Trypanblau-positiven Zellen >99% beträgt.
      1. Lassen Sie die Probe 30 Minuten lang bei Raumtemperatur (20–25 °C) in der Zählkammer und vergewissern Sie sich, dass der Anteil der Trypanblau-positiven Zellen bei >99 % geblieben ist.
   2. Optional: Um zu überprüfen, ob die Elektrodisruption nicht zu hart war, d. h. dass sie keine intrazellulären Organellen gestört hat, führen Sie die Schritte 1.1 bis 3.3 wie oben beschrieben durch, verwenden Sie jedoch ein größeres Ausgangsmaterial (eine Vertiefung aus einer 6-Well-Platte mit einer ~80 % konfluenten Zellschicht) und verwenden Sie 150 μl 10 % Saccharose in Schritt 2.5 und 150 μl phosphatgepufferte Saccharoselösung ohne DTT in Schritt 3.3.
      1. Verwenden Sie eine Pipette, um vorsichtig 200 μl der verdünnten Zellaufschlusslösung auf ein 1,2 ml-Dichtekissen aus phosphatgepuffertem 8 % (w/v) Dichtegradientenmedium (z. B. 8 % Nycodenz, 50 mM Natriumphosphat, 2,2 % Saccharose, 1 mM EDTA) in einem 2 ml-Zentrifugenröhrchen zu schichten. Zentrifugieren Sie bei 20.000 x g für 45 min bei 4 °C in einer Mikrozentrifuge mit Soft-Mode-Funktion (für sanftes Beschleunigen und Abbremsen) und legen Sie die Röhrchen vorsichtig auf Eis.
      2. Entfernen Sie vorsichtig 60 μl der oberen Fraktion von ~200 μl, achten Sie darauf, dass keine Lösung des Dichtegradientenmediums aufgenommen wird, und geben Sie es in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen.
         Anmerkung: Dieser sollte Zytosol von außergewöhnlicher Reinheit enthalten, das als "Zellsaft" bezeichnet wird.
      3. Testen Sie die Reinheit der im obigen Schritt erhaltenen Fraktion, indem Sie Western-Blot-Analysen von organellenhaltigen Proteinen unter Verwendung von Standardtechniken und 4-20% Gradientengelen durchführen.
      4. Führen Sie beispielsweise ein Immunblotting für Cathepsin B, Cytochrom c und Proteindisulfid-Isomerase durch, um sicherzustellen, dass der Elektroschock in Schritt 3.2 die Lysosomen, Mitochondrien bzw. das endoplasmatische Retikulum nicht gestört hat, und Immunoblot für LDH, um das Vorhandensein eines zytosolischen Proteins im Zellsaft zu überprüfen.
      5. Führen Sie parallel dazu ein Immunblotting an Proteinextrakten durch, die aus der gesamten Zellaufschlusslösung hergestellt wurden, um zu bestätigen, dass die verwendeten Antikörper die in Organellen enthaltenen Proteine, die bewertet werden, nachweisen können.
4. Wiederholen Sie die Schritte 3.1 bis 3.3 für jede Probe.
5. Aus jeder verdünnten Zellaufschlusslösung (erhalten in Schritt 3.3) werden 550 μl in 2 ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit 900 μl eiskaltem Resuspensionspuffer (50 mM Natriummonophosphat, 1 mM DTT, 1 mM EDTA und 5,9 % Saccharose, pH 7,5) entnommen, ergänzt mit 0,5 % BSA und 0,01 % Tween-20, und durch Pipettieren kurz gemischt.
6. Zentrifugieren Sie bei 18.000 x g für 45 min bei 4 °C, um Pellets mit "sedimentiertem LDH" herzustellen. Saugen Sie den Überstand gründlich ab (mit Absaugung), um die Pellets so trocken wie möglich zu halten. Legen Sie die Proben in einen -80 °C Gefrierschrank.
7. 150 μl von jeder verdünnten Zellaufschlusslösung (erhalten in Schritt 3.3) werden in neue Röhrchen überführt und die Proben in einen Gefrierschrank bei -80 °C gelegt. Verwenden Sie diese Proben, um die "Gesamt-LDH"-Spiegel in den Zellen zu bestimmen.
   Anmerkung: An dieser Stelle kann das Experiment so lange wie gewünscht pausiert werden.

>4. LDH-Extraktion und Messung der enzymatischen LDH-Aktivität

1. Tauen Sie die "sedimentierte LDH" (aus Schritt 3.6) und die "Gesamt-LDH"-Proben (aus Schritt 3.7) auf Eis auf.
2. Geben Sie 300 μl eiskalten Resuspensionspuffer mit 1,5 % Triton X-405 zu den "Gesamt-LDH"-Proben (was eine endgültige Triton X-405-Konzentration von 1 % ergibt). Drehen Sie die Proben auf einer Walze in einem Kühlraum (4–8 °C) für 30 Minuten.
3. 750 μl eiskalter Resuspensionspuffer mit 1 % Triton X-405 werden zu den "sedimentierten LDH"-Proben gegeben und die Pellets mit einer Pipette resuspendiert, bis eine homogene Lösung erreicht ist.
4. Die Proben aus den Schritten 4.2 und 4.3 werden bei 18.000 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert, um ungelöste Zelltrümmer zu sedimentieren.
5. Mischen Sie 4 Teile kaltes 65 mM Imidazol (pH 7,5)/0,75 mM Pyruvat mit einem Teil kaltes 65 mM Imidazol (pH 7,5)/1,8 mM NADH, um eine Arbeitslösung zu erhalten, die mindestens drei Wochen lang bei 4 °C stabil ist.
6. Mischen Sie 3–30 μl der Überstände aus Schritt 4.4 mit 200 μl der Arbeitslösung aus Schritt 4.5
.
7. Bestimmen Sie die LDH-Menge durch Messung der enzymatischen LDH-Aktivität als Abnahme der Absorption von Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (reduzierte Form) (NADH) bei 340 nm bei 37 °C im Vergleich zu einem Standard mit bekannter LDH-Konzentration. Führen Sie Absorptionsmessungen durch, bis sich die Reaktion dem Abschluss nähert, d.h. bis sich die Extinktion bei 340 nm mit der Zeit nicht mehr ändert.
   Anmerkung: Dies ist die klassische biochemische Methode zur Messung der LDH-Aktivität. Obwohl das aktuelle Protokoll die Reaktion bei 37 °C durchführt, kann sie auch bei Raumtemperatur (20–25 °C) durchgeführt werden, was bei manueller Spektrophotometrie ratsam ist. Das aktuelle Protokoll verwendet ein robotisches Multi-Analysator-Instrument, das Proben automatisch mit der Arbeitslösung in einer 96-Well-Platte mischt und die Extinktion bei 340 nm bei 37 °C alle 20 s für 3 Minuten misst. Danach berechnet die Gerätesoftware die LDH-Konzentration, ausgedrückt in Einheiten (U)/L, indem sie die Steigung der Absorptionsmessungen über die Zeit mit einer Standardkurve vergleicht, die durch Kalibrierung mit einem Standard bekannter LDH-Konzentration erhalten wurde. Der lineare Nachweisbereich bei diesem Ansatz beträgt 30–1.500 U/L. Als Alternative gibt es eine Vielzahl von kommerziell erhältlichen Kits zur Messung der LDH. Einige von ihnen basieren auf der Kopplung der enzymatischen Reaktion an die Erzeugung kolorimetrischer oder fluoreszierender Produkte, was die Detektion mit anderen Mitteln als der UV-Spektrophotometrie und mit anderen linearen Detektionsbereichen ermöglicht.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1,5 ml und 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen	Eppendorf	211-2130 und 211-2120
12-Well-Platten	Falke	353043
Accumax-Lösung zur Zellablösung	Innovative Zelltechnologien	Nr. A7089	Aliquote jahrelang bei -20 °C und einige Monate im Kühlschrank aufbewahren
Bafilomycin A1	Enzo	BML-CM110-0100	In DMSO auflösen
BJ-Zellen	ATCC	CRL-2522	Verwendung im Durchgang <30
Rinderserumalbumin (BSA)	VWR	Artikel-Nr.: 422361V
Burker Zählkammer	Fisher Scientific	Tel.: 139-658585
Countess Zellzählkammer Folien	ThermoFisher Scientfic	Nr. C10228
Gräfin II Automatisierter Zellzähler	ThermoFisher Scientfic	AMQAX1000
Deckglas für die Burker-Zählkammer	Fisher Scientific	Tel.: 139-658586
Criterion Tris-HCl Gel, 4–20 %, 26 Well, 15 μl, 13,3 x 8,7 cm (B x L)	Bio-Rad	3450034
DVB-T	Sigma-Aldrich	Nr. D0632
Earles ausgewogene Salzlösung (EBSS)	Gibco	Artikel-Nr.: 24010-043	Enthält 0,1% Glukose
Edta	Sigma-Aldrich	Nr. E7889
Elektroporationsküvette (4 mm)	Bio-Rad	1652088
Exponentieller Zerfallswellen-Elektroporator	BTX Harvard-Gerät	EMV 630
Fötales Rinderserum (FBS)	Sigma	Nr. F7524	10 % Endkonzentration im Medium RPMI 1640
HEK293-Zellen	ATCC	CRL-1573
Imidazol	Sigma-Aldrich	Artikel-Nr.: 56750	Eine 65 mM Lösung autoklavieren und monatelang im Kühlschrank aufbewahren
Brutkasten; Autoflow IR Direct Heat CO2-Inkubator	NuAire	NU-5510E
Lipofectamine RNAiMAX Transfektionsreagenz	ThermoFisher	13778150
LNCaP-Zellen	ATCC	CRL-1740	Verwendung im Durchgang <30
3-Methyladenin (3MA)	Sigma-Aldrich	Nr. M9281	Lagern Sie 100 mM in RPMI bei -20 °C. Erhitzen Sie das Material 10 Minuten lang auf 65 °C und verwenden Sie es bei einer Endkonzentration von 10 mM
Gekühlte Mikrozentrifuge	Beckman Coulter Biowissenschaften	368831
Gekühlte Mikrozentrifuge mit Soft-Mode-Funktion	Eppendorf	Eppendorf 5417R
MRT67307 Hydrochlorid (ULKi)	Sigma-Aldrich	SML0702	Hemmt die ULK-Kinase-Aktivität. In DMSO auflösen.
MaxMat Multianalysator	Erba Diagnostik	PL-II
MCF7-Zellen	ATCC	HTB-22
Nadh	Merck-Millipore	Artikel-Nr.: 1.24644.001
Nycodenz	Achs-Schild	1002424
Opti-MEM Reduziertes Serummedium	ThermoFisher	31985062
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Gibco	20012-019
Pipettenspitzen 3 (0,5-20 μl)	VWR	Tel.: 732-2223	Thermo Fischer ART Barrier Tipps
Pipettenspitzen (1-200 μl)	VWR	Tel.: 732-2207	Thermo Fischer ART Barrier Tipps
Pipettenspitzen (100-1000μl)	VWR	Tel.: 732-2355	Thermo Fischer ART Barrier Tipps
Pipetten	ThermoFisher	4701070	Finnpipette F2 GLP Kit
Poly-D-Lysin	Sigma-Aldrich	P6407-10X5MG	Stellen Sie eine 1 mg/ml Stammlösung in sterilem H2O her. Diese Lösung ist bei -20 °C mindestens 1 Jahr haltbar.
Pyruvat	Merck-Millipore	1066190050
RPE-1-Zellen (hTERT RPE-1)	ATCC	CRL-4000
RPMI 1640	Gibco	Artikel-Nr.: 21875-037
SAR-405	ApexBio	Nr. A8883	Hemmt die Phosphoinositid-3-Kinase der Klasse III (PIK3C3). In DMSO auflösen.
Schalldämpfer Select Negative Control #1 (siCtrl)	ThermoFisher/Ambion	4390843
Silencer Select ATG9-zielgerichtete siRNA (siATG9A)	ThermoFisher/Ambion	Nr. S35504
Silencer Select FIP200-zielgerichtete siRNA (siFIP200)	ThermoFisher/Ambion	Nr. S18995
Silencer Select ULK1-zielgerichtete siRNA (siULK1)	ThermoFisher/Ambion	Nr. S15964
Silencer Select ULK2-zielgerichtete siRNA (siULK2)	ThermoFisher/Ambion	Nr. S18705
Silencer Select GABARAP-zielgerichtete siRNA (siGABARAP)	ThermoFisher/Ambion	Nr. S22362
Silencer Select GABARAPL1-zielgerichtete siRNA (siGABARAPL1)	ThermoFisher/Ambion	Nr. S24333
Silencer Select GABARAPL2-zielgerichtete siRNA (siGABARAPL2)	ThermoFisher/Ambion	Nr. S22387
Monobasisches Natriumphosphat-Dihydrat (NaH2PO4 • 2H2O)	Merck-Millipore	Artikel-Nr.: 1.06580.1000
Dibasisches Natriumphosphat-Dihydrat (Na2HPO4 • 2H2O )	Prolabo	Artikel-Nr.: 28014.291
Saccharose	VWR	Artikel-Nr.: 443816T	10% Endkonzentration in Wasser; durch 0,45 μm Filter filtrieren und monatelang im Kühlschrank aufbewahren
Thapsigargin	Sigma-Aldrich	Nr. T9033	Hemmt die SERCA ER Ca2+ Pumpe. In DMSO auflösen.
Triton X-405	Sigma-Aldrich	X405	1% endgültig
Trypanblaue Beize 0,4 %	Molekulare Sonden	Nr. T10282
Trypsin-EDTA (0,25 % w/v Trypsin)	Gibco	Artikel-Nr.: 25200-056
Tween-20	Sigma-Aldrich	Nr. P2287	0,01% endgültig