>1. Kulturbedingungen für grün fluoreszierendes Protein, das M. tuberculosis mc26206 (Mtb-GFP) exprimiert
HINWEIS: Der von M. tuberculosis H37Rv abgeleitete auxotrophe Stamm mc26206 (ΔpanCD, ΔleuCD), transformiert mit dem gfp (grün fluoreszierendes Protein), das das Plasmid pMN437 exprimiert, wird in diesem Protokoll verwendet. Es ist möglich, den Mtb-GFP-Stamm durch einen nicht-gfp-exprimierenden Wildtyp-Stamm zu ersetzen, um den Zugang zum Stamm für Forscher zu erleichtern. Die gfp-Expression ist jedoch wünschenswert, um eine visuelle Bestätigung der Phagozytose und der Bildung von Mtb/Makrophagen-Aggregaten zu ermöglichen. Für die Langzeitlagerung wurden Mtb-GFP bei -80 °C in vollständigem 7H9-Medium (beschrieben in Schritt 1.1) eingefroren, das mit 20 % Glycerin versetzt wurde.
- Bereiten Sie das vollständige Mtb-GFP-Medium (7H9-C) vor, indem Sie das 7H9-Medium mit 10 % Middlebrook OADC (Ölalbumin-Dextrose-Katalase), 0,02 % Tyloxapol, 24 μg/ml D-Pantothensäure, 50 μg/mL L-Leucin und 50 μg/ml Hygromycin B ergänzen.
- Tauen Sie eine Durchstechflasche mit Mtb-GFP auf und geben Sie 10 ml 7H9-C in einen 30-ml-PETG-Kolben mit quadratischem Boden.
- Inkubieren Sie bei 37 °C auf einem Rotationsschüttler (50 U/min). Führen Sie alle paar Tage Messungen der optischen Dichte (OD600) durch, bis OD600 1,0 erreicht (ca. 5-8 Tage).
- Verdünnen und Durchgangskultur nach Bedarf, um einen OD600 zwischen 0,2 und 1,0 zu halten.
- Für die Infektion ist eine etablierte Kultur von Mtb-GFP innerhalb der logarithmischen Wachstumsphase (OD600 von 0,6-1) zu verwenden. Um klumpige Kulturen zu vermeiden, wird der Mtb-Kulturkolben ein- bis zweimal pro Woche in einem Wasserbad (130 W; 3 x 5 s Impulse) beschallt.
>2. Kulturbedingungen für THP-1-Zellen
- Bereiten Sie vollständige THP-1-Zellmedien (RPMI-C) vor, indem Sie RPMI 1640-Medium mit 10 % hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum, 2 mM L-Glutamin und 10 mM HEPES (4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure) ergänzen.
- Die Zellen werden in einem T-75-Kolben bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5 % CO2 inkubiert.
- Zählen Sie alle zwei Tage Zellen mit einem Hämozytometer oder einer Durchflusszytometrie und halten Sie die THP-1-Zellen bei einer Dichte zwischen 0,1 und 0,6 Millionen pro ml.
>3. Infektionsprotokoll zur Erzeugung von mtb/macrophagen Aggregatstrukturen
- THP-1-Zellvorbereitung (pro 96-Well-Platte)
- 7 x 106 THP-1 Zellen bei 250 x g für 5 min zentrifugieren. In 7 mL RPMI-C resuspendieren.
- Mtb-GFP Vorbereitung
- Zentrifugieren Sie 2,8 x 108 Mtb-GFP bei 3.200 x g für 5 min in einer Schwingschaufelzentrifuge mit einer Umrechnung von OD600 1,0 = 3 x 108 Bakterien/ml.
- Einmal mit RPMI-C waschen und wie in Schritt 3.2.1 zentrifugieren.
- Resuspendieren Sie in 7 mL RPMI-C und wirbeln Sie 10 s lang.
- Infektion
HINWEIS: Die Vorlage finden Sie in Abbildung 1.
- Bereiten Sie eine 96-Well-Platte vor, indem Sie 200 μl steriles Wasser in den Reihen A und H sowie den Spalten 1 und 12 für einen Wasserrand hinzufügen, um eine Verdunstung des Kulturmediums zu verhindern.
- Fügen Sie 200 μl RPMI-C zu Spalte 2 (B2 bis G2) für die Hintergrundsteuerung hinzu (Blank).
- Um zu infizieren, geben Sie die Mtb-GFP-Suspension (Schritt 3.2) zur THP-1-Zellsuspension (Schritt 3.1) und mischen Sie sie durch Pipettieren gut. Die endgültige THP-1-Zelldichte beträgt 5 x 105 pro ml und die entsprechende Infektionsvielfalt beträgt 40.
- Gießen Sie die THP-1/Mtb-GFP-Suspension in ein 25-ml-Reservoir.
- Geben Sie 200 μl THP-1/Mtb-GFP-Suspension mit einer Mehrkanalpipette in alle verbleibenden 96 Vertiefungen (B3 bis G11).
Anmerkung: Wenn Sie mit mehreren 96-Well-Platten arbeiten, resuspendieren Sie die verbleibende THP-1/Mtb-Suspension regelmäßig im Reservoir, um sicherzustellen, dass jeder Well eine gleichmäßige Mischung zugesetzt wird.
- Inkubieren Sie bei 37 °C mit 5 % CO2 für 7-10 Tage.
- Wechseln Sie das Medium alle 2 Tage, indem Sie langsam 100 μl verbrauchtes Medium von der Oberseite jeder Vertiefung entfernen und vorsichtig 100 μl vorgewärmtes RPMI-C mit einer Mehrkanalpipette hinzufügen. Resuspendieren Sie die Vertiefungen nicht und stören Sie nicht die Mtb/Makrophagen-Aggregate am Boden der Vertiefungen.
- Untersuchen Sie die Vertiefungen täglich visuell durch Fluoreszenzmikroskopie (4-10X-Objektiv) und achten Sie dabei auf die Größe der Mtb/Makrophagen-Aggregate. An Tag 7-10 sollten die Mtb/Makrophagen-Aggregate ausreichend groß sein (siehe Abbildung 2 als Referenz), um mit der Wirksamkeitsprüfung des Arzneimittels fortzufahren (Abschnitt 4).
- Falls gewünscht, können Sie Bilder der 96 Wells mit einem automatisierten Zellbildgebungssystem aufnehmen, das mit Hellfeld- und GFP-Filtersets ausgestattet ist, um die Bildung von Mtb/Makrophagen-Aggregaten zu dokumentieren.
Anmerkung: Wenn der Benutzer keinen Zugang zu einem automatisierten Bildgebungssystem hat, können Bilder von repräsentativen Wells mit jedem geeigneten Mikroskop mit GFP- und Hellfeldfunktionen aufgenommen werden.
>4. Wachstumshemmungs-Assay zur Beurteilung der Wirksamkeit von Arzneimitteln gegen Mtb, die aus Mtb/Makrophagen-Aggregaten gewonnen
werden
- Arzneimittelzubereitung (dreifache Bedingungen für zwei Medikamente)
HINWEIS: Die Vorlage finden Sie in Abbildung 1A.
- Geben Sie in einer separaten 96-Well-Platte 125 μl 7H9-C-Medium zu B2 bis G10.
- Bereiten Sie zwei Arzneimittel mit dem Doppelten der höchsten gewünschten Endkonzentration in 1 ml 7H9-C vor, um die Verdünnung in Schritt 4.2.4 zu berücksichtigen.
- Geben Sie 250 μl jedes Arzneimittels in die Vertiefungen B11-C11-D11 bzw. E11-F11-G11 für dreifache Behandlungen.
- Verdünnen Sie die Testmedikamente mit einer Mehrkanalpipette seriell um das Zweifache, indem Sie 125 μl von B11-G11 in B10-G10 umfüllen. Mischen Sie, indem Sie bei jedem Schritt 5 Mal pipettieren.
- Bewegen Sie weiterhin 125 μl von Säule zu Säule (von rechts nach links) über die Platte und stoppen Sie nach Spalte 4.
- Nach dem Mischen von Säule 4 werden 125 μl in einen Abfallbehälter entsorgt. Die Spalten 2 und 3 sollten keine Arzneimittel enthalten, um die Verwendung als Hintergrund (Blank) und positive Wachstumskontrollen zu ermöglichen.
Anmerkung: Alternativ können Sie die Vorlage in Abbildung 1B zum Testen von Arzneimittelbibliotheken befolgen. Jede 96-Well-Platte kann 58 Arzneimittel in einer einzigen Konzentration aufnehmen. Bereiten Sie diese Wirkstoffplatte mit der doppelten gewünschten Endkonzentration vor, da sie in Schritt 4.2.4 halbiert wird.
- Medikamentöse Behandlung:
- Entnehmen Sie die 96-Well-Platte mit den Mtb-infizierten Makrophagen (Mtb/Makrophagen-Aggregate).
- Dekantieren Sie alle relevanten Wells (B2 bis G11) vorsichtig mit einer Mehrkanalpipette. Führen Sie dies in zwei Schritten durch: Entfernen Sie zuerst 150 μl, ohne die Platte zu kippen, und entfernen Sie dann das restliche Medium (~50 μl), indem Sie die Platte kippen und die Pipettenspitze in die Unterkante der Vertiefung einführen. Da Mtb/Makrophagen-Aggregate am Boden des Bohrlochs haften, sollte kein Material verloren gehen.
- Geben Sie vorsichtig 100 μl 7H9-C-Medium in alle relevanten Vertiefungen (B2 bis G11) der Platte, die die Mtb/Makrophagen-Aggregate enthält.
- Übertragen Sie mit einer Mehrkanalpipette 100 μl von der wirkstoffhaltigen 96-Well-Platte (Schritt 4.1) in die entsprechenden Vertiefungen der Infektionsplatte.
- In einen verschlossenen Beutel geben und 3 Tage bei 37 °C inkubieren.
>5. Quantifizierung der Wirksamkeit von Arzneimitteln mit dem Resazurin-Mikrotiter-Assay
- Bereiten Sie Resazurin-Stammlösung mit einer Endkonzentration von 0,8 mg/ml in H2O vor. Filtrieren Sie zur Sterilisation durch eine Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membran mit einer Porengröße von 0,22 μm.
- Bereiten Sie die Resazurin-Arbeitslösung vor, indem Sie Resazurin-Stammlösung, H2O und Tween-80 (20 % ige Lösung in H2O) im Verhältnis 2:1:1 mischen. Die Endkonzentrationen betragen 0,4 mg/ml Resazurin und 5 % Tween-80.
- Richten Sie mit einem Plattenlesegerät ein Programm ein, um die Fluoreszenz bei 530 nm Anregung und 590 nm Emission alle 30 Minuten für 24 Stunden bei 37 °C zu messen. Plattenlesegerät auf 37 °C vorwärmen.
- 20 μl Resazurin-Arbeitslösung mit einer Mehrkanalpipette in alle relevanten Vertiefungen (B2 bis G11) der arzneimittelbehandelten Platte (Schritt 4.11) geben.
- Legen Sie die Platte auf den Plattenleser und starten Sie das in Schritt 5.3.
eingerichtete Programm
Anmerkung: Um die Verarbeitung großer Volumina von Assay-Platten zu erleichtern, reicht es aus, den Assay in einem 37 °C-Inkubator zu entwickeln und alle 24 Stunden einzelne Fluoreszenz-Reads durchzuführen. Dies gilt auch für Benutzer, die keinen Zugang zu einem Platten-Reader mit Kinetik- und Inkubationsfunktionen haben.
