Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
>1. Tag 1
HINWEIS: Führen Sie alle unten beschriebenen Schritte in einer sterilen Laminar-Flow-Biosicherheitswerkbank durch, die für die Gewebekultur in einem BSL-2-Labor verwendet wird.
- Tauen Sie die Serumproben bei Raumtemperatur auf und geben Sie 100 μl jeder Serumprobe in ein steriles Röhrchen. Die Hitze 30 min bei 56 °C entweder im Wasserbad oder in einem temperaturgeregelten Thermomixer inaktivieren. Führen Sie 10-fache serielle Verdünnungen der Serumprobe im Bereich von 1:1 bis 1:1.000 mit kaltem RPMI-10 (RPMI mit 10% fötalem Rinderserum) durch.
- Übertragen Sie 10 μl der seriell verdünnten Serumprobe in jede Vertiefung einer sterilen 96-Well-V-Bodenplatte. Enthält zwei Sätze von Kontroll-Wells, RPMI-10 nur mit RVPs und ohne Serumprobe und RPMI-10 nur ohne RVPs und ohne Serumprobe. Richten Sie jede Serumprobe und jede RPMI-10-Kontrolle in dreifacher Ausführung ein.
- Nehmen Sie die Dengue-1, 2, 3 und 4 RVPs aus dem -80 °C Gefrierschrank und tauen Sie sie in einem 37 °C warmen Wasserbad auf. Übertragen Sie die aufgetauten RVPs sofort auf Eis. Es erhalten Sie ca. 170 μl RVPs für jede Serumprobe (10 μl RVPs x 3 Wells für jede Serumverdünnung (1:1, 1:10, 1:100, 1:1.000) und 10 μl RVPs x 3 Wells für jedes der RPMI-10 mit RVP-Kontrollwells).
- Pipettieren Sie 10 μl RVPs in jede Vertiefung der 96-Well-V-Bodenplatte, die die Serumprobe enthält, und in die RPMI-10-Kontrollvertiefungen mit RVPs (ohne Serum). Geben Sie RVPs nicht nur in die Vertiefungen des RPMI-10 (keine Serumprobe und kein RVP). Mischen Sie gründlich, indem Sie 5–10 Mal auf und ab pipettieren. Geben Sie 10 μl kaltes RPMI-10 anstelle von RVPs in jede Kontrollvertiefung mit kaltem RPMI-10 (keine Serumprobe und kein RVP).
- Die 96-Well-Platte mit V-Boden in einen Inkubator überführen und die Platte 1 Stunde lang bei 37 °C in Gegenwart von 5 % CO2 inkubieren. Während die 96-Well-V-Bodenplatte inkubiert, reinigen Sie die Oberfläche der Biosicherheitswerkbank mit 70 % Ethanol und lassen Sie das UV-Licht 15 Minuten lang laufen.
- Nehmen Sie einen vollständig konfluenten T75-Kolben mit K562-Zellen aus dem Inkubator, mischen Sie die Zellen gut mit einer sterilen 5-ml-Pipette und geben Sie 5 ml Zellen in ein steriles konisches 15-ml-Röhrchen.
Anmerkung: Die K562-Zellen werden in RPMI-10 gehalten und bei 1 x 106/ml subkultiviert.
- Zählen Sie die Anzahl der Zellen, indem Sie 10 μl Zellen aus dem sterilen konischen 15-ml-Röhrchen entfernen und mit 10 μl Tryphanblau mischen. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer, um die Gesamtzahl der Zellen im konischen 15-ml-Röhrchen zu bestimmen.
- Zentrifugieren Sie den konischen 15-ml-Behälter mit Zellen bei ~1.200 x g für 10 Minuten, dekantieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in warmem RPMI-10 bei einer Konzentration von 80.000 Zellen/30 μl Medium (2,66 x 106 Zellen/ml).
- Nehmen Sie die 96-Well-V-Bodenplatte aus dem Inkubator (Schritt 1.6), geben Sie 30 μl K562-Zellen in jede Vertiefung der 96-Well-V-Bodenplatte und mischen Sie gründlich, indem Sie 5–10 Mal auf und ab pipettieren. Die 96-Well-Platte mit V-Boden wird in einen Inkubator umgefüllt und die Platte 1 Stunde lang bei 37 °C in Gegenwart von 5 % CO2 inkubiert.
- Nach einer 1-stündigen Inkubation die 96-Well-V-Bodenplatte aus dem Inkubator nehmen und 5 Minuten lang bei ~1.200 x g zentrifugieren. Nach der Zentrifugation dekantieren Sie das Medium aus den Vertiefungen, indem Sie die Platte auf den Kopf stellen und in einen Behälter mit 10 % Bleiche legen.
- Waschen Sie die Zellen in jeder Vertiefung, indem Sie sie in 125 μl warmem RPMI-10 resuspendieren, mischen Sie sie gründlich mit einer Pipette und zentrifugieren Sie die Platte 5 Minuten lang bei ~1.200 x g. Dekantieren Sie das Medium, indem Sie die Platte auf den Kopf stellen, in einen Behälter mit 10 % Bleichmittel. Wiederholen Sie diesen Waschschritt zweimal.
- Nach dem Waschen 100 μl warmes RPMI-10 in jede Vertiefung geben, mit der Pipette auf und ab mischen und die Platte 48 Stunden lang bei 37 °C in Gegenwart von 5 % CO2 inkubieren.
>2. Tag 3
- Nehmen Sie die 96-Well-V-Bodenplatte mit 100 μl Zellen und Medien/Vertiefung aus dem Inkubator und stellen Sie sie in eine Biosicherheitswerkbank. Mischen Sie mit einer Mehrkanalpipette den Inhalt jeder Vertiefung und geben Sie die Zellen und Medien in eine 96-Well-U-Bodenplatte oder vorbeschriftete 5-ml-Polypropylenröhrchen.
- Spülen Sie jede Vertiefung in der 96-Well-V-Bodenplatte mit 100 μl 1 % Paraformaldehyd (PFA) in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und geben Sie sie in die entsprechenden Vertiefungen in der 96-Well-U-Bodenplatte oder markierten 5-ml-Polypropylenröhrchen aus Schritt 2.1, um eine Endkonzentration von 0,5 % PFA/Vertiefung oder Röhrchen zu erhalten. Mischen Sie gründlich mit einer Mehrkanalpipette, decken Sie die Platte mit Alufolie ab und lassen Sie sie 30 Minuten lang im Inkubator ruhen, um die Zellen zu fixieren.
- Bereiten Sie das Durchflusszytometer vor (siehe z. B. Materialtabelle), indem Sie ungefärbte K562-Zellen laufen lassen, um die Seiten- und Vorwärtsstreuung zusammen mit den Fluoreszenzeinstellungen zu kalibrieren. Der einzige benötigte Fluoreszenzkanal ist FL1, da GFP die einzige Fluoreszenz ist, die von den Zellen emittiert wird. Erfassen Sie ~30.000 bis 50.000 Zellen aus jeder Probe.
Anmerkung: Jedes Durchflusszytometer, das in der Lage ist, eine einzelne Fluoreszenz zu messen, kann für die Datenerfassung verwendet werden, da Zellen, die mit RVPs infiziert sind, aufgrund des Vorhandenseins von GFP nur grüne Fluoreszenz abgeben und keine anderen Fluoreszenzkanäle benötigt werden.
>3. Datenanalyse
- Analysieren Sie die mit dem Durchflusszytometer erfassten Daten mit einer beliebigen Durchflusszytometrie-Analysesoftware (siehe Materialtabelle).
- Stellen Sie das erste Gate basierend auf FSC-A (Vorwärtsstreuung – Fläche) vs. FSC-H (Vorwärtsstreuung – Höhe) so ein, dass einzelne Zellen einbezogen und autofluoreszierende Dubletten von der Analyse ausgeschlossen werden. Gate dann Singulett-gesteuerte Zellen basierend auf SSC-A (Side Scatter – Area) vs. FSC-A, um autofluoreszierende Ablagerungen auszuschließen.
- Analysieren Sie SSC-A- vs. FSC-A-Gated-Zellen auf die Expression von GFP basierend auf SSC-A vs. GFP-A. Bestimmen Sie den Prozentsatz der GFP+-Zellen für jede Verdünnung der Serum- und Kontrollproben, indem Sie ein Gate um die GFP+-Zellen setzen.
- Bestimmen Sie den durchschnittlichen Prozentsatz der GFP+-Zellen für jede Verdünnungs- und Kontrollverdünnung der Serumprobe, indem Sie den Gesamtprozentsatz der GFP+-Zellen in den dreifachen Wells durch 3 dividieren.
- Berechnen Sie die Faltungsverstärkung der Infektion, indem Sie den durchschnittlichen Prozentsatz der GFP+-Zellen in den Serumproben für jede Verdünnung durch den durchschnittlichen Prozentsatz der GFP+-Zellen in den RPMI-10-Kontrollvertiefungen (ohne Serumprobe) dividieren.
- Zeichnen Sie die Faltungsverstärkung (y-Achse) im Vergleich zur Verdünnung (x-Achse) und führen Sie eine statistische Analyse mit ANOVA durch, gefolgt von Tukeys Post-hoc-Test für Mehrfachvergleiche.
