>1. Screening auf potentielle TLR4-Nanoinhibitoren mit Hilfe der Reporterzellen
HINWEIS: Da die TLR4-Signalübertragung sowohl MyD88-abhängige Land-TRIF-abhängige Signalwege verwendet, wird sie als primäres Ziel ausgewählt, um eine breite Palette von TLR-Signalwegen zu umfassen. THP-1-XBlue-Reporterzellen werden hauptsächlich zur Untersuchung der NF-κB/AP-1-Aktivierung verwendet, während THP-1-Dual-Zellen für die IRF-Aktivierung aus der TRIF-abhängigen Signaltransduktion verwendet werden.
- Ermitteln Sie die optimale LPS-Dosis, indem Sie vor dem Screening eine Dosis-Wirkungs-Kurve erstellen.
- Die LPS-Arbeitslösung auf eine Endkonzentration von 0,01 - 100 ng/ml in R10-Medium verdünnen (Verdünnung in log10-Skala vornehmen). Layout des Plattendesigns und Verdünnung in einer 96-Well-Kulturplatte mit rundem Boden. Stellen Sie sicher, dass jede Vertiefung nach der Verdünnung mindestens 110 μl Lösung enthält.
- Entfernen Sie das Kulturmedium vorsichtig mit einem Vakuumsauger von der Zellaussaatplatte.
- Das in der Verdünnungsplatte (1.1.1) hergestellte LPS-haltige R10-Medium wird entsprechend der Anordnung der Proben in die Kulturplatte überführt. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C (in einem Zellkultur-Inkubator) für 24 Stunden.
- Nach 24 Stunden werden die Überstände (80 μl/Well) vorsichtig in eine neue 96-Well-Platte mit rundem Boden überführt. Führen Sie den kolorimetrischen und/oder Luziferase-Lumineszenz-Assay an diesen Lösungen sofort durch oder lagern Sie sie vor der Entwicklung des Assays bei 4 °C (mehrere Stunden) oder -20 °C (Tage).
Anmerkung: Das Design des Plattenlayouts sollte für Experimente und Datenanalysen einfach und übersichtlich sein. Für jede Bedingung sollten 2-4 Wiederholungen in Betracht gezogen werden. Fügen Sie immer eine negative Kontrollgruppe (LPS null) hinzu. Es wird empfohlen, THP-1-XBlue-Zellen für die NF-κB/AP-1-Aktivierung zu verwenden, da die Dual-Zellen nach der Differenzierung zu Makrophagen einen relativ hohen Hintergrund für die NF-κB/AP-1-Aktivierung aufweisen. Es ist jedoch möglich, die Dual-Zellen sowohl für die Berichterstattung über NF-κB/AP-1 als auch über die IRF-Aktivierung zu verwenden.
- Entwicklung des kolorimetrischen Assays für die NF-κB/AP-1-Aktivierung und des Luciferase-Lumineszenz-Assays für die IRF-Aktivierung.
- Um die NF-κB/AP-1-Aktivierung zu beurteilen, überführen Sie 20 μl Überstand jeder Probe in eine neue 96-Well-Kulturplatte mit flachem Boden und geben Sie 180 μl vorgewärmte SEAP-Substratlösung in jede Vertiefung. Die Platte bei 37 °C 1 - 2 h inkubieren, damit sich die Farbe entfalten kann (rosa bis dunkelblau). Erfassen Sie die Absorption bei 655 nm auf einem Plattenleser.
Vorsicht: Die Inkubationszeit kann je nach Farbentwicklung variiert werden (30 min bis zur Inkubation über Nacht). Es wird empfohlen, zu warten, bis die optische Dichte (O.D.) der dunkelsten Farbe über 1 liegt, während die Sättigung der Farbentwicklung (O.D. >3) vermieden wird.
- Für die Analyse der IRF-Aktivierung werden 10 μl Überstand jeder Probe in eine klare weiße 96-Well-Platte mit flachem Boden überführt. Fügen Sie die Luciferase-Lösung (50 μL) hinzu und sammeln Sie die Lumineszenz sofort gut.
Anmerkung: Es wird dringend empfohlen, einen Lumineszenzplatten-Reader mit Auto-Injektionsfunktion zu verwenden, um die Konsistenz der Lumineszenzmessung von Well zu Well und von Platte zu Platte zu gewährleisten. Wenn die Substratlösungen manuell injiziert werden, stellen Sie bitte sicher, dass die Inkubationszeit und die Messeinrichtung für jede Vertiefung konsistent sind.
- Führen Sie den Screening-Assay an verschiedenen Peptid-GNP-Hybriden mit 10 ng/mL LPS-Stimulation durch (basierend auf 1.1). Befolgen Sie das gleiche Verfahren in Abschnitt 1.2 für die Entwicklung des Reporter-Assays.
- Konzentrieren Sie die Peptid-GNP-Hybride auf 200 nM in einem R10-Medium unter Verwendung der Zentrifugationsmethode. Zentrifugieren Sie 20 Volumina der Hybridlösung (10 nM) bei 18.000 x g für 30 min und entsorgen Sie die Überstände vorsichtig. Sammeln Sie die Hybriden (am Boden der Tube) in einer Tube, waschen Sie sie zweimal mit PBS und suspendieren Sie die Hybriden in einem Volumen des R10-Mediums.
- Mischen Sie gleiche Volumina der konzentrierten Hybriden und des LPS (20 ng/ml), das R10-Medium enthält, um eine Endkonzentration der Hybriden und LPS von 100 nM bzw. 10 ng/ml zu erhalten.
- Nehmen Sie das Kulturmedium aus der Kulturplatte und geben Sie 100 μl der gemischten Lösung in jede Vertiefung (3 Wiederholungen für jede Bedingung); fügen Sie eine Negativkontrolle (nur Medium) und eine LPS-Kontrolle (10 ng/ml LPS ohne Hybride) hinzu.
- Nach einer 24-stündigen Inkubation bei 37 °C wird das Medium jeder Vertiefung in ein Röhrchen überführt und die Röhrchen bei 18.000 x g, 4 ΰC für 30 Minuten zentrifugiert. Die Überstände (50-80 μl/Röhrchen) werden in eine 96-Well-Platte mit rundem Boden gegeben und der Reporterassay wird wie in Abschnitt 3.2.
beschrieben durchgeführt.
Vorsicht: Wenn die Überstände nach der Zentrifugation verworfen werden, die Hybride am Boden des Röhrchens nicht rühren.
Anmerkung: Die Zentrifugation in Schritt 1.3.4 ist sehr wichtig, um die nicht internalisierten Nanopartikelhybride aus dem Kulturmedium zu entfernen, und kann die Interferenz der Hybride mit den kolorimetrischen/Lumineszenzmesswerten vermeiden. Denn die Gold-Nanopartikel können je nach Größe und Agglomeration weite Wellenlängen des Lichts absorbieren.
>2. Validierung der hemmenden Wirkung der potentiellen Kandidaten
HINWEIS: Um die hemmende Wirkung der potenziellen Kandidaten aus dem Screening zu bestätigen, werden zwei Ansätze verwendet. Eine besteht darin, die Dosiswirkungen der Stimulanzien (LPS) bei einer festen Hybridkonzentration (oder umgekehrt) zu untersuchen; die andere besteht darin, die Hemmung der NF-κB/AP-1- und IRF3-Signale durch Immunblotting direkt zu betrachten.
- Bei Ansatz eins wird der Reporter-Assay mit 100 nM der Bleihybride und zwei LPS-Konzentrationen bei 1 ng/ml und 10 ng/ml nach den gleichen Verfahren durchgeführt, die in 1.3 beschrieben sind. Nehmen Sie einen inaktiven Hybriden (basierend auf den Screening-Ergebnissen) als Hybridkontrolle zum Vergleich auf.
- Für den Immunblotting-Ansatz befolgen Sie bitte die experimentellen Standardverfahren.
- Kultivieren Sie THP-1-Zellen in R10-Medium, säen Sie die Zellen in eine 12-Well-Kulturplatte (2 x 106 Zellen/Well) und differenzieren Sie sie zu Makrophagen, indem Sie die Zellen 24 Stunden lang mit 50 ng/ml PMA behandeln, gefolgt von einer Ruhepause von 2 Tagen.
- Nach der Zelldifferenzierung stimulieren Sie die Zellen mit 10 ng/ml LPS mit/ohne die Hybride (100 nM) über einen längeren Zeitraum (bis zu 4 h). Bereiten Sie die Zelllysate zu verschiedenen Zeitpunkten (0, 5, 15, 30, 60, 120 und 240 min) für das Immunblotting vor. Schließen Sie eine inaktive Hybride als Steuerelement ein.
- Sondieren Sie die Signale von IκBα, phosphoryliertem p65 und phosphoryliertem IRF3, um die inhibitorische Wirkung der Leithybride auf die Aktivierung von NF-κB und IRF3 zu untersuchen. Untersuchen Sie die β-Aktin- und die gesamten IRF3-Signale als interne Kontrollen.
Anmerkung: Die Signaltransduktion erfolgt oft viel schneller (in wenigen Stunden) als die Expression der Reporterenzyme SEAP und Luciferase (24 h). Es wird dringend empfohlen, als weitere Validierungsmethode auch einen Viabilitätsassay der getesteten Hybriden nach 24 h durchzuführen.
>3. Bewertung der TLR-Spezifität
HINWEIS: Um die TLR-Spezifität des Leitpeptid-GNP-Hybrids zu untersuchen, werden andere TLR-Signalwege getestet, darunter TLR2, TLR3 und TLR5. TLR7, 8 und 9 werden ausgeschlossen, da die THP-1-abgeleiteten Makrophagen aufgrund der fehlenden TLR7-, 8- und 9-Expression in Makrophagen nicht gut auf die Stimulation dieser TLRs ansprechen.
- Testen Sie verschiedene Konzentrationen (1 ng/ml bis 25 μg/ml) der für TLR2 (Pam3CSK4), TLR3 (Poly I:C) und TLR5 (Flagellin) spezifischen Liganden an beiden von Reporterzellen abgeleiteten Makrophagen, um die optimale Konzentration nach dem gleichen Verfahren in 1.1 und 1.2 zu erhalten.
- Die Zellen werden mit den Mischungen des Leithybrids (100 nM) und jedes TLR-Liganden in der von 3.1 erhaltenen Konzentration behandelt, um die inhibitorische Spezifität des Leithybrids gemäß dem in 1.3 beschriebenen experimentellen Verfahren zu bewerten. Schließen Sie den inaktiven Hybrid als Steuerelement zum Vergleich ein.
