Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Isolierung von Organen
HINWEIS: Das Virus ist bei Raumtemperatur (RT) nicht stabil, daher muss die Anzahl der gleichzeitig geernteten Tiere sorgfältig geplant werden, um die Virustiter zu erhalten.
- Infizieren Sie Mäuse mit der gewählten Dosis und dem gewählten Weg, basierend auf dem erforderlichen Phänotyp. Für dieses Protokoll infizieren Sie 8-10 Wochen alte männliche und weibliche Typ-I-Interferonrezeptor-defiziente (Ifnar1-/-) C57BL/6-Mäuse.
- Betäuben Sie Ifnar1-/- Mäuse mit einem Cocktail aus Ketamin (90 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg). Testen Sie den Pedalreflex durch ein festes Einklemmen der Zehen, um die Anästhesie zu bestätigen. 1 x 105 Focus forming Units (FFU) ZIKV in 50 μL subkutan (SC) über das Fußpolster verabreichen.
- Bereiten Sie alle für die Ernte benötigten Materialien am Vortag vor: 2 Scheren, Pinzetten und 20 ml 70%iges Ethanol (EtOH) in einem 50-ml-Kegel zur Desinfektion der Werkzeuge.
- Bereiten Sie Spritzen und Nadeln vor: eine 20-ml-Spritze für die Perfusion, 23-ml-Nadeln (ca. 1 pro Käfig) und 1 ml-Spritze mit 25-g-Nadeln (1 pro 3-5 Mäuse). Fügen Sie vor dem Wiegen von Röhrchen Stahlperlen (in der Haube) zu 1,5 mL O-Ring-Schraubverschlussröhrchen hinzu (eine für jedes Organ). Die Röhrchen müssen für die Homogenisierung geeignet sein.
- Bereiten Sie am Tag der Ernte die Materialien vor, die für die Durchblutung und das Einfrieren der Organe benötigt werden.
- Füllen Sie einen Eiskübel mit Trockeneis und 70% EtOH, um ein Eisbad zu machen. Bereiten Sie sterile phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) vor, wobei Sie davon ausgehen, dass 25-30 ml PBS pro Maus für jede Perfusion benötigt werden; 5-10 ml für das Rückenmark). Holen Sie sich eine Anästhesie, einen Cocktail aus Ketamin und Xylazin, und nehmen Sie 300 μl pro Maus an. Legen Sie alle Materialien und alle zusätzlichen Röhrchen, die für die Durchflusszytometrie usw. benötigt werden, in einen Sekundärbehälter, um sie zur Tierhaltung zu transportieren.
- Befolgen Sie alle notwendigen Verfahren für den Zugang, einschließlich des An- und Ausziehens der persönlichen Schutzausrüstung beim Ein- und Ausgang in die Tieranlage.
Vorsicht: Alle Verfahren sind in einer zertifizierten Biosicherheitswerkbank in einem Labor der Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2) durchzuführen.
- Verabreichen Sie eine Anästhesie, 200-500 μl, intraperitoneal, abhängig von der Größe und dem Gewicht des Tieres. Wenn Sie alleine arbeiten, verabreichen Sie jeweils einem Tier eine Anästhesie, um zu vermeiden, dass die Tiere vor der Organentnahme getötet werden.
- Bestätigen Sie die Anästhesiedosis, indem Sie den Zeh mit einer Zange einklemmen, um den Pedalreflex zu bewerten. Fahren Sie nicht fort, es sei denn, Sie reagieren nicht vollständig. Befestigen Sie die Maus mit Stecknadeln an einer Wachsplatte. Übergießen Sie die Maus zu diesem Zeitpunkt mit 70%igem Ethanol, um eine Kontamination der Haare bei der Organentnahme zu vermeiden.
- Unheilbare Blutung durch Herzpunktion.
- Öffnen Sie das Tier mit der Schere und der Pinzette durch die Brusthöhle, um das Herz freizulegen. Entnahme von Blut per Herzpunktion (~800 μL), dies kann für mehrere Assays verwendet werden, einschließlich klinischer Chemie, Hämatologie, Durchflusszytometrie zum Nachweis antigenspezifischer Reaktionen und quantitativer Echtzeit-PCR (qRT-PCR) zur Analyse der viralen Kopienzahl.
- Für die virale RNA-Analyse mittels qRT-PCR ist die Blutentnahme in einem EDTA-Röhrchen bei der Extraktion aus Vollblut oder in einem Mikrozentrifugenröhrchen bei der Extraktion aus Serum zu entnehmen. (Für Serum drehen Sie das Röhrchen 20 Minuten lang mit maximaler Geschwindigkeit in einer Zentrifuge bei Raumtemperatur und nehmen Sie das Serum in ein separates Röhrchen). Fügen Sie der Serumprobe nach der Fertigstellung ein lineares Polyacrylamid als Träger hinzu. Die RNA kann dann analysiert oder bei -80 °C gelagert werden, um sie zu einem späteren Zeitpunkt weiterzuverarbeiten.
- Füllen Sie die 20-ml-Spritze bei Raumtemperatur (oder 37 °C) mit PBS und perfundieren Sie die Mäuse, indem Sie die Schmetterlingsnadel in den linken Ventrikel einführen. Punktion des rechten Vorhofs, damit Blut und PBS austreten können. Verabreichen Sie das PBS langsam, während Sie die Farbe der Leber überprüfen, um sicherzustellen, dass das Tier vollständig durchblutet ist. Die Leber sollte sich von tiefroter zu rosa lachsfarbener Farbe verfärben.
- Wenn Sie die Organe für die Histologie vorbereiten, lassen Sie die Schmetterlingsnadel an Ort und Stelle und perfundieren Sie sie dann mit 20 ml eiskaltem 4%igem Paraformaldehyd. Wenn ja, ist es praktisch, die Spritze an einen 3-Wege-Absperrhahn anzuschließen, an dem beide Spritzen befestigt sind, wobei das Ventil ein- und ausgeschaltet wird, während man zwischen PBS und PFA wechselt.
- Entnehmen Sie Organe in beschriftete, gewogene Röhrchen. Befolgen Sie bei peripheren Organen eine festgelegte Reihenfolge für die Entnahme: Leber, Milz, Niere und Lunge.
- Nehmen Sie nur einen Lappen aus der Leber; es spielt keine Rolle, welcher, aber versuchen Sie bei allen Experimenten immer, den gleichen Lappen mit dem gleichen Stück zu nehmen. Nehmen Sie in ähnlicher Weise für Nieren und Lunge die gleiche Niere und Lunge. Wenn auch die Durchflusszytometrie durchgeführt werden soll, kann jedes Organ in zwei Hälften geschnitten werden. Lagern Sie die Hälfte, die für die Zytometrie verwendet werden soll, in Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) bei Raumtemperatur, bis die Ernte abgeschlossen ist.
- Unmittelbar nach der Ernte geben Sie jedes Organ in ein beschriftetes Röhrchen und legen es in das Trockeneisbad. Der Virustiter nimmt mit der Zeit bei Raumtemperatur ab, so dass die Zeit, die für die Organentnahme benötigt wird, äußerst wichtig ist. Es muss Konsistenz zwischen den Mäusen geben, daher ist nach der Sicherheit die nächste Priorität die Geschwindigkeit.
Anmerkung: Bei der Entnahme von Organen für virale Titer ist es sehr hilfreich, dass zu diesem Zeitpunkt eine zweite Person das Gehirn entnimmt, um die viralen Titer zu erhalten.
- Entferne die restlichen Organe aus der Körperhöhle der Maus, um Zugang zu Wirbelsäule und Schädel zu erhalten.
- Entferne die Maus vom Brett und entferne das Fell, gefolgt von der Entfernung der Arme und Beine.
Entfernen Sie den Kopf der Maus mit einer Enthauptungs-, stumpfen oder chirurgischen Schere, um das Gehirn zu entnehmen, indem Sie den Schädel mit einer gezackten LaGrange-Schere durch das Foramen magnum schneiden. Schälen Sie dann den Schädel mit einer Zange ab und schöpfen Sie das Gehirn mit einem Spatel heraus.
- Entferne mit einer starken, stumpfen Schere die Rippen und andere Knochen, die die Wirbelsäule umgeben. Schneiden Sie dann quer über den Beckenknochen und legen Sie das Foramen vertebrale auf Lendenwirbelsäule frei. Die kleine Spitze des Rückenmarks sollte an dieser Stelle sichtbar sein.
- Verwenden Sie eine 10-ml-Spritze, die mit PBS gefüllt ist, und eine 18-g-Nadel, um das Rückenmark auszustoßen, indem Sie das Rückenmark von der Lendenwirbelsäule zur Halswirbelsäule über eine Petrischale "spülen".
- Platzieren Sie die abgeschrägte Spitze der Nadel vorsichtig in das Foramen der Wirbelsäule und vermeiden Sie übermäßigen Druck, um zu verhindern, dass die Nadel in den Wirbelkörper eindringt. Halten Sie fest, um Druck auf den Wirbelkörper und die Nadel auszuüben, und drücken Sie den Spritzenkolben, um die Nabelschnur auszustoßen. Übertragen Sie sofort das Rückenmark in den beschrifteten Schlauch und legen Sie ihn in das Trockeneisbad.
- Wiederholen Sie den Vorgang mit allen Tieren, bis die Ernte abgeschlossen ist. Legen Sie die Erntewerkzeuge in das 70%ige Ethanol zwischen den Tieren. Konzentrieren Sie sich auf Konsistenz und Geschwindigkeit. Die Zeitspanne zwischen den einzelnen Organentnahmen sollte konstant bleiben, um die Ergebnisse des Virustiters nicht zu verfälschen.
- Wenn Sie fertig sind, desinfizieren Sie die Biosicherheitswerkbank und sämtliches Material, bevor Sie es aus der Tierhaltung entfernen.
- Nehmen Sie jedes Röhrchen aus dem Eisbad und wiegen Sie die Röhrchen, um das Organgewicht zu bestimmen. Um das Gewicht der Organe zu bestimmen, subtrahieren Sie das Gewicht der leeren Röhre vom Gewicht der organhaltigen Röhre.
HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt können Organe bei -80 °C eingefroren werden, um sie zu einem späteren Zeitpunkt weiter zu verarbeiten, oder die Organe können unmittelbar vor dem Einfrieren einzelner Aliquots homogenisiert werden. Mehrfaches Einfrieren von Proben verringert den Virustiter. Daher ist es wichtig, für alle Experimente innerhalb eines einzigen Projekts das gleiche Verfahren durchzuführen.
>2. Homogenisierung von Organen
- Bereiten Sie 3 markierte 1,5-ml-Röhrchen mit Schnappverschluss für jedes zu homogenisierende Organ vor.
- Wenn die Proben nicht unmittelbar nach der Ernte homogenisiert werden, die Röhrchen bei -80 °C entfernen. Die Proben müssen zur Homogenisierung nicht aufgetaut werden.
- Legen Sie die Proben auf Eis, um sie kalt zu halten und den Virustiterverlust zu minimieren. Geben Sie dann 1 ml kaltes DMEM mit 5 % FBS in jedes organhaltige Röhrchen.
- Sofort die Röhrchen in einem Rührbesen nach Herstellerangaben aufschlagen. Homogenisieren Sie alle Organe mit Stahlkügelchen in einem Kügelchen-Homogenisator-Instrument. Prüfen Sie, ob jedes Organ vollständig homogenisiert wurde.
- Organreste werden in einer Mikrofuge bei 12.000 x g für 5 min in einer auf 8 °C abgekühlten Mikrofuge heruntergeschleudert. Lege dann die Schläuche wieder in den Eiskübel. In der Biosicherheitswerkbank aliquotieren Sie die Proben in Röhrchen für die notwendigen Assays. Lege dann die Schläuche wieder in den Eiskübel.
- Für den fokusbildenden Assay aliquotieren Sie 500 μl in ein markiertes Röhrchen. Lege dann die Röhrchen im Gestell auf einen Eiskübel. Aliquotieren Sie 50 μl in ein Röhrchen für RNA für die fluorogene quantitative RT-PCR (qRT-PCR) zur Messung der Kopienzahl des viralen Genoms.
- Isolieren Sie die Gesamt-RNA aus den Organen der infizierten Tiere mit einem kommerziellen RNA-Isolationskit. Bestimmung der viralen RNA von Flaviviren mit den für ZIKV spezifischen Primer-Sonden-Sets, die einzigartige Sequenzen in jedem Flavivirus-Genom erkennen. Bestimmung der viralen Kopienzahl unter Verwendung eines Kopienkontrollplasmids, das eine definierte positive einzelsträngige RNA enthält, die in vitro unter Verwendung einer T7-Polymerase erzeugt wurde, die die ZIKV-Zielsequenzen enthält.
- Die verbleibende Probe, die etwa 300 μl beträgt, wird in das dritte Röhrchen aliquotiert und bei Bedarf bei -80 °C gelagert.
HINWEIS: Wenn die Proben nicht zuvor eingefroren wurden, frieren Sie sie bei -80 °C ein. Wenn die Proben zuvor eingefroren wurden, fahren Sie mit dem fokusbildenden Assay und/oder der RNA-Isolierung fort, bevor Sie den Vorgang stoppen.
>3. Zika-Virus-Fokusbildungs-Assay
HINWEIS: Es ist wichtig, eine Viren- und eine Positivkontrolle einzuschließen. Bei der Positivkontrolle handelt es sich um eine Verdünnungsreihe eines Virusbestandes mit bekannter Konzentration. Nicht alle Kontrollen müssen sich auf derselben Platte befinden, aber wenn der Assay größer als 5 Platten wird, sollten weitere Kontrollen hinzugefügt und auf die Platten verteilt werden. Achten Sie darauf, dass Sie die Monoschicht weder mit den Pipettenspitzen noch durch kräftiges Waschen zerkratzen. Es können mehrere Organe am selben Tag oder an verschiedenen Tagen getitert werden. Ein einzelnes Organ sollte jedoch nicht über mehrere Tage getitert werden, da unterschiedliche Testbedingungen den Virustiter beeinflussen können. Es wird dringend empfohlen, ein einzelnes Organ an einem einzigen Tag laufen zu lassen.
- Bereiten Sie vor dem Tag des Assays die Zellen und Reagenzien vor, die für den fokusbildenden Assay benötigt werden.
- Bereiten Sie ein Wachstumsmedium vor, das 500 mL DMEM mit 5 mL HEPES und 25 mL FBS enthält. Lassen Sie vor Beginn des Assays Zellen der Vero-Weltgesundheitsorganisation (WHO) in Wachstumsmedien bei 37 °C und 5 % CO2 wachsen. Die Vero-Zellen sollten vor Beginn des Assays keine hohe Passage aufweisen oder jemals über 100 % Konfluenz gewachsen sein.
- Bereiten Sie 500 ml einer 2%igen Methylcelluloselösung vor, indem Sie eine 1-Liter-Glasmedienflasche mit 10 g Methylcellulose und einen großen Rührstab sowie eine separate 1-Liter-Glasmedienflasche mit 500 ml H2O autoklavieren. Wenn das autoklavierte Wasser abgekühlt ist, erhitzen Sie es in der Mikrowelle, bis sich die Flasche heiß anfühlt, aber nicht kocht.
- Gießen Sie vorsichtig warmes/heißes Wasser in eine Flasche mit Methylcellulose, während Sie sich in der Gewebekulturhaube befinden. Verschließen Sie die Flasche teilweise und rühren Sie auf der Herdplatte, bis die Methylcellulose in Lösung ist (1-4 h). Aliquotieren Sie die 2%ige Methylcelluloselösung in ein steriles konisches 50-ml-Röhrchen. 2% Methylcellulose kann bis zur Verwendung bei 4 °C gelagert werden.
- Bereiten Sie eine 5%ige Paraformaldehydlösung in PBS zum Fixieren der Platten vor und lagern Sie sie bis zur Verwendung bei 4 °C. Bereiten Sie einen 1x Focus Forming-Assay-Waschpuffer vor, indem Sie 0,05 % Triton X-100 zu PBS hinzufügen und bei RT lagern. Bereiten Sie einen 1x FFA-Färbepuffer vor, indem Sie PBS 1 mg/ml Saponin zugeben und bis zur Verwendung bei 4 °C lagern. Diese können ein bis zwei Wochen im Voraus vorbereitet werden.
- Berechnen Sie die Anzahl der für den Assay benötigten 96-Well-Platten mit flachem Boden, sodass jedes Organ in dreifacher Ausfertigung plattiert wird. Fügen Sie genügend zusätzliche Vertiefungen für Positiv- und Negativkontrollen hinzu.
- Züchten Sie genügend Vero-Zellen in Wachstumsmedien, um den entworfenen Assay abzuschließen. Trypsinisieren Sie die Vero-Zellen und zählen Sie sie, indem Sie sie resuspendieren, mit 1,5 x 105 Zellen pro ml in Wachstumsmedien. Vero-Zellen in den 96-Well-Platten mit flachem Boden bei 3,0 x 104 Vero-WHO-Zellen/Platte in Wachstumsmedien durch Zugabe von 200 μl pro Vertiefung plattieren.
- Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 37 °C und 5 % CO2 und stellen Sie sicher, dass die Platten im Inkubator waagerecht sind, damit die Zellen gleichmäßig in der Vertiefung verteilt sind.
HINWEIS: Jedes Labor züchtet Vero-Zellen etwas anders; Das Ziel ist eine 90-95%ige konfluente Monoschicht in jeder Vertiefung am Tag des Assays auf das Zika-Virus.
- Verdünnen Sie die Zika-Virusproben am Tag des Assays. Wenn die Organproben zuvor homogenisiert wurden, nehmen Sie die Proben aus dem -80 °C Gefrierschrank und lassen Sie sie auftauen, bevor Sie die Proben für den Assay auf Eis legen.
- Bereiten Sie auf dem Eis eine 96-Well-Platte mit rundem Boden vor, indem Sie 180 μl kaltes Wachstumsmedium in die Reihen B bis H geben, wobei Reihe A leer bleibt. 150 μl jeder homogenisierten Organprobe werden in Reihe A der runden Bodenplatte gegeben.
- Bereiten Sie serielle 10-fache Verdünnungen jeder Probe mit einer Mehrkanalpipette vor. Verdünnen Sie die Proben in einer 96-Well-Platte mit rundem Boden, indem Sie 20 μl Probe in 180 μl Wachstumsmedium geben und die Pipettenspitzen zwischen jeder Verdünnung wechseln.
- Bereiten Sie die Fokusformungsplatte vor, indem Sie das Medium von der 96-Well-Platte mit flachem Boden entfernen, die die Vero-Zellen abdeckt. Tun Sie dies unmittelbar vor der Zugabe der Virusproben, um ein Austrocknen der Monoschicht zu verhindern.
- Geben Sie 100 μl der Virusverdünnung in jede Vertiefung in der Vero-Platte. Fügen Sie eine Probe mit demselben Satz Spitzen hinzu, indem Sie von der niedrigsten zur höchsten Konzentration wechseln. Rockplatten 2-4 Mal von Seite zu Seite und dabei darauf achten, dass sie nicht verwirbelt werden.
- Inkubieren Sie bei 37 °C, 5 % CO2 für 1-2 h. Stellen Sie sicher, dass die Platten im Inkubator waagerecht sind. Während der Inkubation erwärmen Sie 2% Methylcellulose auf RT.
- 2%ige Methylcelluloselösung in Wachstumsmedien verdünnen. Die Verdünnung sollte in einem Verhältnis von etwa 2:1 von 2%iger Methylcellulose zu Wachstumsmedium erfolgen. Bewahren Sie es bei Raumtemperatur auf, bis es Zeit ist, es zu verwenden. Geben Sie 1-2 Tropfen/Vertiefung (stellen Sie die Pipette auf 125 μl ein) des Methylcellulose-Wachstumsmediums in jede Vertiefung der 96-Well-Platte.
- 32-40 h bei 37 °C, 5 % CO2 inkubieren. Da die Vero-Zellen bei jedem etwas anders wachsen, können Faktoren wie Zellkonfluenz und Stamm des Zika-Virus die Inkubationszeit verändern.
- Fixieren Sie die Vero-Zellen mit der vorbereiteten 5%igen Paraformaldehydlösung.
- Geben Sie 50 μl 5 % Paraformaldehyd in jede Vertiefung über der Oberseite der Methylcelluloseschicht in der Biosicherheitswerkbank. 60 min bei RT inkubieren. Die Fixierung kann über Nacht bei 4 °C erfolgen, aber die Platte mit Parafilm abdecken, um die Verdunstung zu reduzieren.
- Entleeren Sie das Overlay und das Medium von den Zellen in einen Entsorgungsbehälter in der Biosicherheitswerkbank. Vorsichtig mit PBS, 150 μl/Well, waschen. Entfernen Sie PBS von den Platten und entfernen Sie die Platte von der BSL-2.
- Wiederholen Sie den PBS-Waschgang 2x und fügen Sie 150 μl/Vertiefung hinzu. Entfernen Sie dann das PBS. Fügen Sie 150 μL/Well, 1x FFA-Waschpuffer hinzu und lassen Sie es 5-10 Minuten bei RT ruhen, um die fixierten Zellen zu permeabilisieren.
- Erkennen Sie eine Infektion mit einem primären Zika-Antikörper. Bereiten Sie den Primärantikörper 4G2 (D1-4G2-4-15) in einer Konzentration von 1 μg/ml in FFA-Färbepuffer vor. Bereiten Sie genügend Antikörper für den gesamten Assay vor.
Anmerkung: Halten Sie sich von Laborwindeln oder anderen stark fusselnden saugfähigen Materialien fern, da sich die Fasern negativ auf die Bildgebung der Herde auswirken.
- Entfernen Sie den FFA-Waschpuffer von den Platten. Geben Sie 50 μl/Vertiefung des Primärantikörpers in den FFA-Färbepuffer. Die Platten mit Parafilm verschließen und über Nacht bei 4 °C auf einer Wippplattform inkubieren. Der Assay kann mit einer Inkubation von 2 Stunden bei RT durchgeführt werden.
- Visualisieren Sie die Infektion durch Zugabe eines sekundären HRP-konjugierten Antikörpers. Bereiten Sie den sekundären Ziegen-Anti-Maus-HRP-markierten Antikörper in einer Konzentration von 1:5.000 im FFA-Färbepuffer vor. Bereiten Sie genügend Antikörper für den gesamten Assay vor.
- Waschen Sie die Zellen 3x mit FFA-Waschpuffer und entfernen Sie den Waschpuffer, indem Sie ihn jedes Mal in die Spüle schnippen. Färben Sie die Zellen mit dem Sekundärantikörper in FFA-Färbepuffer bei 50 μl/Well. 1-2 h bei RT inkubieren.
- Waschen Sie die Zellen 3x mit FFA-Waschpuffer und entfernen Sie den Waschpuffer, indem Sie ihn jedes Mal in die Spüle schnippen. Fügen Sie 50 μl/Vertiefung des Trueblue-Substrats hinzu.
- Beobachten Sie die Platten sorgfältig und warten Sie 2-15 Minuten, bis die Flecken vollständig definiert sind und der Hintergrund minimal ist. Nachdem die Flecken sichtbar sind, waschen Sie die Monoschicht vorsichtig mit Wasser und schützen Sie sie mit der Hand vor der Kraft des fließenden Wassers. Auf Papiertücher (KEINE WINDELN) klopfen und so schnell wie möglich abbilden.
- Die Fleckenzählung kann manuell oder mit Hilfe eines automatischen Spotzählers erfolgen. Bei manueller Zählung kann ein Präparierbereich verwendet werden, um die Visualisierung zu unterstützen.
- Wählen Sie für jede Probe eine Verdünnung mit leicht unterscheidbaren Foki (z. B. 20 bis 200 pro Well) und berechnen Sie den Titer in fokusbildenden Einheiten pro ml (FFU/ml) unter Verwendung des Durchschnitts der doppelten Wells: FFU/mL = (mittlere Foki/Well) × (Verdünnungsfaktor) ÷ (mL Inokulum).
