Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
>1. Blutabnahme und Isolierung von Blutplättchen
- Entnahme von menschlichem Blut von einwilligenden gesunden erwachsenen Spendern durch Venenpunktion am Tag des Experiments in 3,8 % Trinatriumcitrat. Ein 4,5-ml-Röhrchen Blut reicht aus, um genügend plättchenreiches Plasma (PRP) für 20-25 Erkrankungen bei Spendern zu erhalten, deren Thrombozytenzahl nahe bei 250 x 103 pro μl liegt.
Anmerkung: Vermeiden Sie die Blutentnahme über schmale Nadeln (kleiner als 21 G).
- PRP durch Zentrifugation bei 22 °C und 140 x g für 12 min mit langer Bremse herstellen. Dies führt zu zwei unterschiedlichen Schichten, mit roten Blutkörperchen unten und dem hellen PRP oben.
- Isolieren Sie die obere, trübe, gelbe Schicht des PRP durch vorsichtiges Pipettieren durch eine Pipettenspitze, die in einem Winkel von 45° geschnitten ist, und erhalten Sie die Thrombozytenzahl über ein vollständiges Blutbild (CBC).
- Falls erforderlich, die Blutplättchen in 1,4-Piperazindiethansulfonsäure-Natriumsalz (PIPES)-gepufferter Kochsalzlösung (150 mM Natriumchlorid, NaCl, 20 mM PIPES) in Gegenwart von Prostaglandin E1 (PGE1) waschen und in Tyrodenpuffer (134 mM NaCl, 0,34 mM Dinatriumhydrogenphosphat, Na2 HPO4, 2,9 mM Kaliumchlorid, KCl, 1 mM Magnesiumchlorid, MgCl2, 5 mM Glukose, 12 mM Natriumbicarbonat, NaHCO3, 20 mM 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethensulfonsäure, HEPES, pH 7,35) mit 5 mM Glukose, andernfalls fahren Sie mit Schritt 1.5 fort. Die folgenden Schritte beschreiben das Waschen in Kürze.
- Stellen Sie das PRP-Volumen mit PIPES-gepufferter Kochsalzlösung auf 10 mL ein und fügen Sie 0,6 μM PGE1 hinzu.
- Zentrifugieren Sie 8 Minuten lang bei 1.900 x g, verwerfen Sie dann den Überstand und lassen Sie das Plättchenpellet 5 Minuten lang in 400 μl Tyrode- und Glukoselösung ruhen.
- Suspendieren Sie das Plättchenpellet vorsichtig wieder und lassen Sie es 30 Minuten lang ungestört.
- Stellen Sie die Thrombozytenzahl auf ~250 x 103 Blutplättchen pro μl mit gepooltem humanem plättchenarmem Plasma (PPP) ein und halten Sie die Suspension ungestört oder unter sanfter Rotation bei 22 °C.
2. Antikörper- und gleichmäßige Scherbehandlung
HINWEIS: Alle Schritte in Abschnitt 2, die Pipettieren erfordern, sollten langsam durchgeführt werden, um keine Scherung zu verursachen.
- Geben Sie den gewünschten Antikörper in das PRP oder die gewaschenen Blutplättchen und mischen Sie vorsichtig, indem Sie auf und ab pipettieren oder mit einer Pipettenspitze umrühren. 5-10 min ungestört bei Raumtemperatur stehen lassen. Einer Negativkontrolle wird ein entsprechendes Volumen an PPP oder Tyrode-Puffer zugesetzt.
- Schalten Sie das Kegel-Platte-Viskosimeter ein, stellen Sie die Plattentemperatur auf 22 °C ein und lassen Sie die Platte diese Temperatur erreichen.
- Pipettieren Sie das behandelte PRP oder die gewaschenen Blutplättchen direkt in der Mitte der Platte auf das temperaturgesteuerte Kegel-Platte-Viskosimeter. Stellen Sie sicher, dass sich die gesamte Probe zwischen dem Kegel und der Platte an der Kontaktstelle und nicht an der Außenseite des Kegelrandes ablagert.
- Scheren Sie mit einer angemessenen Geschwindigkeit und Dauer.
- Berechnen Sie die Scherung, wie im Handbuch des Viskosimeters angegeben oder wie zuvor gezeigt.
- Bestimmen Sie die Schergeschwindigkeit aus der Viskosität und der gewünschten Scherspannung über das Newtonsche Viskositätsgesetz;
; die Plasmaviskosität beträgt 1,5-1,6 Centipoise (cP). Zum Beispiel liegt ein normaler Scherbereich für den menschlichen Kreislauf bei 5-30 dyn/cm2, und die Scherung sollte auf der einstelligen Minutenzeitskala angewendet werden.
- Heben Sie den Kegel leicht von der Platte ab (~2 mm), so dass die Probe sowohl mit der Platte als auch mit dem Kegel in Kontakt bleibt, und verwenden Sie eine Gellade- oder eine andere lange Pipettenspitze, um 5-10 μl von der Mitte des Probenvolumens zu sammeln.
- Inkubieren Sie die gescherten Proben mit den gewünschten Markern für 20 Minuten bei Raumtemperatur. Für Marker für Phosphatidylserin, β-Galaktose und P-Selektin wird die Lactadherin-C2-Domäne (LactC2) bei 0,08 μM, Erythrina cristagalli Lektin (ECL) bei 6,25 μg/ml bzw. der Anti-P-Selektin-Antikörper (20 μg/ml) verwendet.
- Die Proben sind vor der Verdünnung oder Kühllagerung 20 Minuten lang in 2 % Paraformaldehyd bei RT zu fixieren und mit Schritt 3.1 fortzufahren oder die Proben nicht länger als 12 Stunden bei 4 °C zu lagern.
>3. Nachweis von Oberflächenmarkern und Vernetzung mittels Durchflusszytometrie
- Analysieren Sie die Probe mittels Durchflusszytometrie und erfassen Sie mindestens 20.000 Ereignisse für jede Erkrankung.
- Quantifizieren Sie die Signalstärke der Fluoreszenzmarker anhand des Höhenwerts für die Intensität jedes Fluorophors oder der geometrischen mittleren Fluoreszenzintensität (MFI).
- Wenn Sie eine Thrombozytenvernetzung nach einer Scherbehandlung nachweisen möchten, analysieren Sie die Probe auf einem bildgebenden Durchflusszytometer und quantifizieren Sie die Vernetzung anhand von Flächen- und Aspektverhältnisparametern.
- Erstellen Sie ein Histogramm der Fläche und/oder des Seitenverhältnisses.
- Verwenden Sie eine Negativkontrolle mit Rinderserumalbumin (BSA) oder Vehikel, um ein Gate zu zeichnen, das die meisten vollständig kreisförmigen Ereignisse ausschließt (dieses Gate wird normalerweise mit einem Seitenverhältnis von ~0,8 gezeichnet) und quantifizieren Sie den Prozentsatz der Ereignisse innerhalb dieses Gates. Bei Ereignissen mit einem niedrigeren Seitenverhältnis ist die Wahrscheinlichkeit höher, dass sie miteinander verknüpft werden.
