Bewertung des antimikrobiellen Potenzials von Bacteriocin-produzierenden fäkalen Bakterienisolaten der Maus

Zusammenfassung

Quelle: Bäuerl, C., et al. Eine Methode zur Bewertung der Auswirkungen von Bacteriocin auf die Darmmikrobiota von Mäusen. J. Vis. Exp. (2017).

Dieses Video zeigt den Nachweis von Bakteriocin produzierenden Milchsäurebakterien, die aus Fäkalien von Mäusen gewonnen werden. Der Assay bestimmt die antimikrobielle Aktivität von Bacteriocin auf bestimmte Bakterienstämme.

Protokoll

>1. LAB-Zählung und Bacteriocin-Aktivität

1. Wiegen Sie ein Kotpellet von jeder Probe in einem 1,5-ml-Röhrchen und fügen Sie ein ausreichendes Volumen eiskalter 0,9 % NaCl hinzu, um eine 10%ige (w/v) Lösung zu erhalten. Verwenden Sie sterile Mikrostößel für 1,5-ml-Röhrchen, um die Stuhlsuspension zu homogenisieren, und bereiten Sie zehnfache Serienverdünnungen in eiskaltem 0,9 % NaCl vor.
2. Zählen Sie die Gesamtzahl der LAB-Zellen.
   1. Verdünnte Zellen (100 μl) auf 4 mL vorgewärmten Man Rogosa Sharpe (MRS) Soft-Agar (50 °C, 0,8 % Agar) übertragen. Mischen Sie durch Vortexen, bevor Sie die Zellen auf eine feste MRS-Agarplatte (1,5 % Agar) gießen.
   2. Trocknen Sie die Platte, indem Sie den Deckel für 5 - 10 Minuten in der sterilen Haube abnehmen, bevor Sie die Zellen 20 - 24 Stunden bei 30 °C für das Zellwachstum und die Koloniebildung inkubieren.
3. Zählen Sie Bakteriocin-produzierende Zellen.
   1. Verdünnte Zellen (100 μl) des Bakteriocin-Produzenten werden auf 4 mL vorgewärmten MRS-Weichagar (50 °C, 0,8 % Agar) übertragen, durch Vortexen gemischt und die Zellen auf eine MRS-Agarplatte (1,5 % Agar) gegossen; diese Schicht wird als erste Schicht bezeichnet.
   2. Übertragen Sie weitere 4 mL zellfreien MRS-Soft-Agar (0,8 % Agar) auf die erste Schicht, um alle Zellen in den Soft-Agar einzubetten.
      Anmerkung: Diese Schicht soll verhindern, dass Zellen als Kolonien auf der Oberfläche der Agarplatten wachsen. Zellen, die an der Oberfläche wachsen, werden leicht verschoben, wenn Indikatorzellen auf die Oberseite gegossen werden (Schritt 4.3.4) und erschweren daher die Interpretation der Ergebnisse. Diese Schicht wird als zweite Schicht bezeichnet.
   3. Trocknen Sie die Platte, indem Sie den Deckel 5 - 10 Minuten in der sterilen Haube abnehmen, bevor Sie sie 20 - 24 Stunden bei 30 °C inkubieren, um das Zellwachstum und die Koloniebildung zu fördern.
   4. Zur Identifizierung von Bakteriocin-produzierenden Kolonien werden 40 μl einer Übernachtkultur eines geeigneten Indikatorstamms mit 4 ml vorgewärmtem Weichagar gemischt. Gießen Sie die Mischung auf den Teller; Diese Schicht wird als dritte Schicht bezeichnet.
   5. Trocknen Sie die Platte, indem Sie den Deckel 5 - 10 Minuten in der sterilen Haube abnehmen, bevor Sie sie 20 - 24 Stunden bei 30 °C inkubieren, um das Zellwachstum und die Koloniebildung zu fördern.
      Anmerkung: Bacteriocin-produzierende Kolonien haben klare (Hemm-)Zonen um die Kolonien herum (Abbildung 1).

Ergebnisse

Abbildung 1: Nachweis der Bacteriocin-Produktion im LAB, das aus dem Kot durch ein Drei-Schichten-Protokoll gewonnen wurde (wie im Verfahren beschrieben)

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Petrischale aus Kunststoff	Thermo Scientific	101VR20
Gehirn-Herz-Infusionsbrühe	Conda	1400
Europäischer bakteriologischer Agar	Pronadisa	Nr. 1800
Agarose D1 Niedriger EEO	Pronadisa	8010
1x TAE-Puffer	Thermo Scientific	15558042
MRS Brühe	Difco	Artikel-Nr.: 288130
PBS-Tabletten	Sigma	P4417-100TAB
Maßstab	Mettler Toledo	PB602-S

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