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Methodenartikel

Ein in vitro Assay zur Quantifizierung des intrazellulären Wachstums von Parasiten in Makrophagen

862 Aufrufe

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8. Juli 2025

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Quelle: Sarkar, A., et al. Die Quantifizierung des intrazellulären Wachstums in Makrophagen ist eine schnelle und zuverlässige Methode zur Beurteilung der Virulenz von Leishmania-Parasiten. J. Vis. Exp. (2018).

Dieses Video zeigt einen Assay zur Quantifizierung des intrazellulären Wachstums von Parasiten in aus dem Knochenmark stammenden Makrophagen (BMMs). Die Makrophagenzellen sind mit den beweglichen und nicht-beweglichen invasiven Stadien der Leishmanien, metazyklischen Promastigoten bzw. Amastigoten infiziert. Die Parasiten dringen in die Makrophagen ein, werden in einer parasitophoren Vakuole internalisiert und vermehren sich im Inneren. Das intrazelluläre Parasitenwachstum wird unter Verwendung eines Mikroskops quantifiziert, indem die Makrophagen und Parasitenkerne fluoreszierend gefärbt werden.

Protokoll

>1. Beschichtung von BMMs auf Deckgläsern gegen Infektionen

  1. Bereiten Sie 6-Well-Gewebekulturplatten vor, indem Sie vier (4) sterile 12-mm-Glasdeckgläser (autoklaviert und in einem geschlossenen Glasbehälter aufbewahrt) in den Boden jeder leeren Vertiefung legen.
    Anmerkung: Entnehmen Sie jedes sterile 12-mm-Deckglas mit einer Aspirationsspitze, die an einer Vakuumleitung befestigt ist. Legen Sie Deckgläser ohne Überlappung in die Vertiefungen und lösen Sie sie an der gewünschten Position, indem Sie das Rohr zusammendrücken, um das Vakuum zu unterbrechen.
  2. Aspirieren Sie Medien (und alle nicht adhärenten Zell....

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Ergebnisse

figure-results-1
Abbildung 1: Eine repräsentative Darstellung einer BMM-Infektion mit virulenten axenischen Amastigoten (A) und nicht-virulenten Log-Phasen-Promastigoten (B) von L. amazonensis. Immunfluoreszenzbilder von Makrophagen, die aus BALB/c-Mäusen isoliert wurden, 1 h und 48 h nach der Infektion. Infizierte Makrophagen wurden auf Immunfluoreszenz untersucht, wie im Protokoll beschrieben. .......

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Offenlegungen

Es wurden keine Interessenkonflikte angegeben.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
6-Well-ZellkulturplatteCellstarArtikel-Nr.: 657160
AdeninAcros OrganicsAC147440250
Aerosol-Barriere-Pipettenspitzen (100-1000 μL)FisherbrandTel.: 02-707-404
Aerosol-Barriere-Pipettenspitzen (20-200 μL)FisherbrandTel.: 02-707-430
Aerosol-Barriere-Pipettenspitzen (2-20 μL)FisherbrandTel.: 02-707-432
Bard-Parker Chirurgische Klinge aus Kohlenstoffstahl #10Aspen ChirurgischArtikel-Nr.: 371110
BD Luer-Lok Spitze 10 mL SpritzeBecton Dickinson (BD)309604
BD Precisionglide Nadel, 25GBecton Dickinson (BD)305124
Zellkulturschale 35 mm x 10 mmCellstar627 160
ZellkulturflascheCellstar660175
Deckgläser: 12 mm KreiseFisherbrandTel.: 12-545-80
DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindol, Dihydrochlorid)InvitrogenNr. D1306
D-BiotinJ.T. BäckerNr. C272-00
EdtaSigma AldrichEds
Ethylalkohol 200 ProofPharmco-AAPER111000200
Falcon 100 mm x 15 mm Petrischale aus nicht TC-behandeltem PolystyrolCorning351029
Fötales RinderserumSeradigm1500-500
Ficoll400Sigma AldrichNr. F8016
FluoreszenzmikroskopNikonE200
Anti-Maus Ziege IgG Texas rotInvitrogenT-862
Anti-Kaninchen-IgG für Ziegen AlexaFluor488InvitrogenNr. A-11034
HeminTokyo Chemical Industry Co. LtdH0008
HEPES (1M)GibcoArtikel-Nr.: 15630-080
Isoton II VerdünnungsmittelBeckman Coulter8546719
L-GlutaminZwillingeNr. 400-106
Mittel 199 (10-fach)GibcoArtikel-Nr.: 11825-015
Na-Pyruvat (100 mM)GibcoArtikel-Nr.: 11360-070
ParaformaldehydAlfa AesarArtikel-Nr.: 43368
Penicillin/StreptomycinZwillingeNr. 400-109
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (-/-)ThermoFisher14200166
Konische Zentrifugenröhrchen aus Polypropylin 15 mLCellstarTel.: 188 271
Konische Zentrifugenröhrchen aus Polypropylin 50 mLCellstarTel.: 227 261
ProLong Gold Antifading-ReagenzThermoFisherNr. P36930
Ratte Anti-Maus Lamp-1 AntikörperEntwicklungsstudien Hybridom-Bank1D4B
Rekombinantes humanes M-CSFPeproTech300-25
Reichert Bright-Line-HämozytometerHausser ScientificNr. 1492
RPMI Medium 1640 (1-fach)GibcoArtikel-Nr.: 11875-093
Triton X-100 TensidMillipore SigmaTX1568-1
Trypan-BlauSigma AldrichNr. T8154
Zarte Schere, 4 1/2"VWRArtikel-Nr.: 82027-582
Präparierzange, feine SpitzeVWRTel.: 82027-386
ObjektträgerVWRTel.: 16004-368
Z1 Schar-Partikelzähler, doppelte SchwelleBeckman Coulter6605699
kg

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