>1. Beschichtung von BMMs auf Deckgläsern gegen Infektionen
- Bereiten Sie 6-Well-Gewebekulturplatten vor, indem Sie vier (4) sterile 12-mm-Glasdeckgläser (autoklaviert und in einem geschlossenen Glasbehälter aufbewahrt) in den Boden jeder leeren Vertiefung legen.
Anmerkung: Entnehmen Sie jedes sterile 12-mm-Deckglas mit einer Aspirationsspitze, die an einer Vakuumleitung befestigt ist. Legen Sie Deckgläser ohne Überlappung in die Vertiefungen und lösen Sie sie an der gewünschten Position, indem Sie das Rohr zusammendrücken, um das Vakuum zu unterbrechen.
- Aspirieren Sie Medien (und alle nicht adhärenten Zellen) aus Petrischale, die mit adhärenten Makrophagen aus dem Knochenmark beschichtet sind, und spülen Sie adhärente Zellen vorsichtig 2x mit steriler, auf 37 °C vorgewärmter Dulbecco-Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung ohne Calcium und Magnesiumchlorid (PBS -/-).
- Geben Sie tropfenweise 5 mL steriles 1x PBS -/- mit einer Endkonzentration von 1 mM EDTA in jede Petrischale und inkubieren Sie es 5 Minuten lang bei 37 °C, um anhaftende BMMs zu lösen. Vergewissern Sie sich, dass die Zellen mit einem Mikroskop abgelöst wurden.
- Sammeln Sie alle abgelösten Zellen, die in 1x PBS -/- mit 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) in einem konischen 50-ml-Röhrchen suspendiert sind. Spülen Sie jede Schale 2x mit 5 mL PBS -/- aus und geben Sie sie in das Zellsuspensionsbecken.
Anmerkung: Die Zellsuspension kann mit zusätzlichem PBS -/- verdünnt werden, um Makrophagen während des Entnahmeprozesses vor EDTA-Toxizität zu schützen.
- Zentrifugieren Sie bei 300 x g für 10 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Makrophagen in 5 - 10 mL BMM-Medium durch Pipettieren. Legen Sie die resuspendierten Zellen auf Eis, um ein Anhaften an den Röhrchen und Verklumpen zu verhindern.
- Zählen Sie lebensfähige Zellen mit dem Trypanblau-Ausschluss im Hämozytometer.
Anmerkung: Zur Zählung von BMM-Zellen, die in 5 ml Medium resuspendiert sind, ermöglicht eine Verdünnungsmischung aus 25 μl Zellsuspension in 445 μl PBS -/- und 30 μl 0,4 % Trypanblau-Lösung in der Regel eine einfache Quantifizierung in einem Hämozytometer (unter Berücksichtigung eines 20-fachen Verdünnungsfaktors für die endgültige Berechnung). Zählen Sie nur Zellen, die nicht mit Trypanblau gefärbt wurden (lebensfähige Zellen). Das Volumen der Zellsuspension kann verändert werden, wenn diese Mischung zu konzentriert oder verdünnt ist. Im Allgemeinen variiert die Ausbeute an BMM pro Präparat zwischen 2 x 107 und 5 x 107 Zellen mit einer einzigen Maus.
- Bereiten Sie die Zellsuspension in BMM-Medium in der gewünschten Plattierungskonzentration (5 x 105/ml) vor und dispergieren Sie die Suspension auf 6 Well-Platten in 2 mL Medium pro Well, so dass jede Vertiefung 1 x 106 Makrophagen aufnimmt.
Anmerkung: Dies ist ein kritischer Schritt, der sicherstellt, dass jede Vertiefung die ausreichende Anzahl von Makrophagen erhält, um die Deckgläser gleichmäßig zu bedecken. Prüfen Sie, ob sich die Deckgläser in den Vertiefungen nicht überlappen oder im Medium schwimmen. Wenn ja, stellen Sie es vorsichtig mit einer sterilen Pipettenspitze ein.
- Über Nacht bei 37 °C, 5 % CO2 inkubieren.
>2. Reinigung von infektiösen Formen von L. amazonensis
HINWEIS: Bereiten Sie Leishmanien auf Infektionen vor - reinigen Sie metazyklische Promastigoten aus stationären Promastigotenkulturen oder differenzieren Sie Promastigoten in Kultur in Amastigotenform unter Verwendung des Standardprotokolls für die axenische Differenzierung von L. amazonensis.
- Aufreinigung von metazyklischen Leishmania-Promastigoten mit Hilfe von Dichtegradientenmedien (Materialien)
- Bereiten Sie eine 40%ige Stammlösung aus Dichtegradientenmedien in sterilem, endotoxinfreiem Wasser vor.
- Verdünnen Sie die Dichtegradientenlösung in 10x M199 Medium (ohne Serum), um eine 10%ige Konzentration im M199 Medium herzustellen.
- Filtern Sie alle Lösungen durch einen 0,22 μm Filter.
Anmerkung: Stammlösungen können bei 4 °C im Dunkeln nicht länger als 1 Monat gelagert werden.
- Geben Sie 2 ml Medienlösung mit 40 % Dichte in den Boden eines konischen 15-ml-Zentrifugenröhrchens.
- Schicht 2 ml einer Medienlösung mit 10 % Dichtegradient in M199 auf die Medienschicht mit 40 % Dichtegradient vorsichtig auftragen, wobei eine Pasteurpipette verwendet wird, um eine Vermischung zwischen den beiden Schichten zu vermeiden.
- 1 x 109 Parasiten aus der stationären Phase durch Zentrifugation bei 1.900 x g für 10 min sammeln.
- Resuspendieren Sie die Zellen in 6 mL Dulbecco's Modified Essential Medium (DMEM).
- Schicht 2 ml der Zellsuspension direkt auf die Medienschicht mit 10 % Dichtegradienten, vorsichtig mit einer Pasteurpipette, um eine Vermischung zwischen den Schichten zu vermeiden.
- Zentrifugieren Sie den Gradienten 10 min lang bei 1.300 x g bei Raumtemperatur.
Anmerkung: Aufgrund der unterschiedlichen physikalischen Eigenschaften zwischen den Leishmanien-Arten müssen die Zentrifugationsbedingungen für jede Leishmanien-Spezies möglicherweise leicht angepasst werden, um eine maximale Ausbeute zu gewährleisten.
- Sammeln Sie Parasiten (angereichert in metazyklischer Promastigotenform) aus der Bande, die an der oberen Grenze des 10%-Dichtegradienten-Mediums (Grenzfläche zwischen den 0%- und 10%-Dichtegradienten-Medienschichten) gebildet wird.
- Verdünnen Sie die Parasiten mit einem Volumen DMEM und sammeln Sie sie durch Zentrifugation (1.900 x g für 10 min bei Raumtemperatur).
- Resuspendieren Sie in 500 μl DMEM-Medium und zählen Sie in einem Hämozytometer, um die Ausbeute zu quantifizieren.
- Erzeugung von L. amazonensis amastigotes unter axenischen Kulturbedingungen (niedriger pH-Wert / erhöhte Temperatur).
- 5 ml Promastigotenkultur in logaritärer Phase (pH 7,4 bei 26 °C) mit einem gleichen Volumen Amastigotenmedium (pH 4,5) mit 25 cm 2 Kolben (insgesamt 10 ml Medium) mischen und über Nacht bei 26 °C inkubieren.
- Den Kolben von 26 °C auf 32 °C umstellen.
- Nach 3 bis 4 Tagen 1:5 in Amastigotenmedien bei 32 °C teilen.
- Überprüfen Sie die Parasiten in den nächsten 3 - 4 Tagen (maximal 7 Tage), um zu sehen, ob sie für den Einsatz bei Infektionen bereit sind.
Anmerkung: Gesunde axenische Amastigoten sollten eine ovale Form ohne sichtbare Geißeln haben. Teilweise differenzierte Amastigoten haben eine große ovale Form mit kurzen Geißeln. Die Kultur sollte nicht viele Klumpen aufweisen – viele Klumpen sind ein Hinweis auf nicht wachsende, absterbende Parasiten. Die Amastigotenkultur kann 1:5 geteilt und maximal 3 Wochen lang aufbewahrt werden.
>3. Infektion mit L. amazonensis
- Verdünnen Sie die Parasitensuspensionen entsprechend dem gewünschten MOI (in der Regel 3-5 metazyklische Promastigoten pro Makrophage [MOI von 1:3 oder 1:5] und 1 Amastigote pro Makrophage [MOI 1:1]). Geben Sie Leishmania in PBS -/- in einem Volumen von 50 - 100 μl in jede Vertiefung, die bereits 2 mL Medium enthält.
- Inkubieren Sie BMMs für 1 h mit Amastigoten und 3 h mit metazyklischen Promastigoten bei 34 °C für die Infektion.
Anmerkung: Die optimale Infektionstemperatur kann je nach Art variieren.
- Nach der Inkubation die freien Parasiten in jeder Vertiefung 3x mit 2 mL PBS -/- gründlich abwaschen, vorgewärmt auf 37 °C.
Anmerkung: Dispergieren Sie PBS vorsichtig, um sicherzustellen, dass Deckgläser nicht übereinander schwimmen. Schwenken Sie die Platte vorsichtig und saugen Sie dann die Flüssigkeit ab. Verwenden Sie separate Aspirationsspitzen, wenn Sie mehrere Parasitenstämme verwenden, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden.
- Fixieren Sie Proben zu einem Zeitpunkt von 1 h oder 3 h, indem Sie jede Vertiefung 10 Minuten lang mit 1,5 - 2 mL 2% PFA in PBS -/- inkubieren. Waschen Sie 3x mit PBS -/-. Aspirieren Sie die letzte Wäsche nicht und kühlen Sie Platten mit Deckgläsern in PBS nicht, bis sie fleckig geworden sind.
- Geben Sie 2 ml frisches BMM-Medium in jede Vertiefung auf Platten für weitere Zeitpunkte und inkubieren Sie bei 34 °C.
- Befestigen Sie die verbleibenden Zeitpunkte wie in Schritt 4.3 beschrieben und kühlen Sie die Platten bis zum Färben.
>4. DAPI-Färbung und Deckglasmontage
- Aspirieren Sie PBS aus Vertiefungen mit Deckgläsern und fügen Sie 1,5 mL PBS -/- mit 0,1 % nichtionischem Reinigungsmittel hinzu. 10 min bei Raumtemperatur inkubieren, gefolgt von 3x Waschen mit 2 mL PBS -/-.
- 1 ml PBS -/- mit 2 μg/ml 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) (verdünnt von 5 mg/ml Stammlösung in Wasser) in Vertiefungen mit Deckgläsern geben und weitere 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
Anmerkung: Die Inkubationszeit mit DAPI ist entscheidend für die korrekte Visualisierung von intrazellulären Leishmania-Parasiten. Makrophagenkerne färben sich aufgrund ihrer größeren Größe und ihres DNA-Gehalts schnell, aber die Färbung der Zellkerne der intrazellulären Parasiten ist langsamer. Daher ist eine Verlängerung der Inkubationszeit über das hinaus, was für die Visualisierung der BMM-Kerne erforderlich ist, notwendig, damit DAPI die Plasmamembran des Parasiten und die Kernmembran des Parasiten durchdringen kann. Mit der richtigen DAPI-Färbung kann neben der Kern-DNA auch die mitochondriale Kinetoplasten-DNA in der Nähe der Flagellentasche des Parasiten sichtbar gemacht werden.
- Waschen Sie jede Vertiefung mit Deckgläsern 3x mit 2 mL PBS -/- und heben Sie dann die Deckgläser mit einer Pinzette an und drehen Sie sie um, um die Zellseite nach unten zu platzieren und mit einem handelsüblichen Antifading-Einbettreagenz auf Glasobjektträger zu montieren.
Anmerkung: Deckgläser sind extrem zerbrechlich und erfordern einen vorsichtigen Umgang. Vermeiden Sie es, beim Anheben Druck auf sie auszuüben, insbesondere nicht gegen die Seitenwand der Vertiefungen. Die Zugabe von ein paar Tropfen PBS -/- reduziert die Oberflächenspannung zwischen dem Deckglas und der Vertiefung und erleichtert den Hebevorgang. Eine feine Nadel kann verwendet werden, um die Deckgläser vom Boden der Vertiefung zu lösen. Nachdem Sie ein Deckglas auf den Objektträger gelegt haben, drücken Sie es vorsichtig mit einer Pinzette nach unten, um eventuelle Luftblasen im Eindeckmedium herauszudrücken. Wenn ein Deckglas während des Hebevorgangs gebrochen ist oder möglicherweise umgeklappt ist, montieren Sie es nicht wieder. Verwenden Sie einfach das vierte Ersatzdeckglas.
- Kühlen Sie die Objektträger bis zur Quantifizierung.
>5. Quantifizierung von Infektionen
- Untersuchen Sie DAPI-gefärbte Objektträger unter einem Fluoreszenzmikroskop, indem Sie Makrophagen mit einer 100-fachen Objektivlinse mit Immersionsöl fokussieren (Anregung bei 358 nm; optimale Emission bei 461 nm).
Achten Sie darauf, dass der Fokus auf der Schicht der Makrophagen zwischen Objektträger und Deckglas liegt.
- Quantifizieren Sie die Anzahl der Makrophagen (große Kerne, die mit DAPI gefärbt wurden) und die Anzahl kleinerer Amastigotenkerne, die um jeden Makrophagenkern gruppiert sind (siehe Abbildung 1A, DAPI) für jedes Gesichtsfeld mit einem manuellen Zähler.
Anmerkung: Amastigotenkerne sind aufgrund ihrer geringen Größe möglicherweise nicht alle in einer Fokusebene sichtbar. Zählen Sie diejenigen, die sichtbar sind, wenn sie auf Makrophagenkerne fokussiert werden, und verwenden Sie dann die Feinfokussierung, um in den Ebenen über und unter den Makrophagenkernen nach Parasitenkernen zu suchen.
- Wechseln Sie in ein anderes Sichtfeld, um die Quantifizierung zu wiederholen. Verwenden Sie einen separaten Zählerschlüssel, um die Anzahl der gezählten Felder nachzuverfolgen. Bewegen Sie sich in parallelen Reihen über jedes Deckglas durch die Gesichtsfelder, um Zählüberlappungen zu vermeiden.
- Quantifizieren Sie mindestens 200 Makrophagen pro Deckglas. Quantifizieren Sie jeden Zeitpunkt der Infektion in dreifacher Ausfertigung (3 Deckgläser). Zählen Sie das vierte Deckglas, wenn eines der vorherigen aufgrund von Deckglasüberlappung, schlechter Montage, Glasbruch usw. nicht zum Zählen geeignet ist
Anmerkung: Wenn 200 Makrophagen auf keinem Deckglas gezählt werden können, zähle den vierten Ersatz.
- Berechnen Sie die Infektionsraten als Amastigoten/Makrophagen oder Amastigoten/100 Makrophagen und bestimmen Sie den Prozentsatz der infizierten Makrophagen aus den Rohquantifizierungsdaten.
