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>1. Vorbereitung von Bakterien
HINWEIS: Ganzzellbakterielle Substrate und gereinigte Peptidoglykane werden als Enzymsubstrate sowohl im Mikroobjektträger-Diffusionsassay als auch im Farbstofffreisetzungsassay verwendet. Diese Substrate müssen vor der Durchführung der Enzymreaktionen vorbereitet werden. Das folgende Protokoll beschreibt ihre Vorbereitung.
- Substrat ganzer bakterieller Zellen
- Herstellung von bakteriellem Zellsubstrat durch Beimpfung von 500 ml Nährbrühe mit einer 2 ml Übernachtkultur von Bacillus subtilis 168 (American Type Culture Collection; ATCC 23857). Inkubieren Sie bei 30 °C unter Schütteln (125 U/min), bis die Kultur eine exponentielle Wachstumsphase erreicht, die als schnelle Wachstumsphase definiert ist, die zu einer Verdoppelung der Bakterienkultur führt. Für die Kultivierung von Salmonella enterica subsp. enterica (ATCC 10708) verwenden Sie Nährbrühe als Nährboden bei 37 °C unter Schütteln (125 U/min).
- Jede Kultur wird durch 10-minütiges Autoklavieren bei 121 °C und 3 atm Druck hitzeabgetötet.
- Ernten Sie das hitzeabgetötete Bakteriensubstrat durch Zentrifugation für 20 min bei 5.000 x g. Waschen Sie das Pellet dreimal mit Wasser Typ 1 und suspendieren Sie es mit einer minimalen Menge Wasser. In dieser Studie suspendieren Sie die Substrate in 1.200 μl.
- 300 μl der bakteriellen Zellsubstrate in 1,5 ml Mikrofuge-Röhrchen aliquotieren und bei 20 °C lagern.
>2. Substrat-Markierung - Remazol Brilliant Blue R Farbstoff-Markierung
HINWEIS: Im Farbstofffreisetzungsassay ist das Substrat kovalent an den Remazol Brillantblau R-Farbstoff gebunden. Das folgende Protokoll beschreibt die Herstellung von gefärbten Enzymsubstraten.
- Herstellung einer 250 mM Natriumhydroxid (NaOH)-Lösung, indem 1 g NaOH in 99 ml Wasser Typ I gelöst wird, die zur Herstellung einer 200 mM Remazol Brilliant Blue R Farbstoff (RBB) verwendet wird.
- Stellen Sie eine 200 mM RBB-Lösung her, indem 1,25 g RBB in 98,75 ml ± 1 ml einer frischen 250 mM NaOH-Lösung gelöst werden.
- Hitzeabgetötete Bakterienzellen werden in einer Konzentration von 0,5 g Nassgewicht in 30 ml RBB-Lösung resuspendiert. Für gereinigtes Peptidoglykan resuspendieren Sie das Peptidoglykan in einer Konzentration von 0,3 g Nassgewicht in 30 ml RBB-Lösung.
- Das Reaktionsgemisch wird in einem Erlenmeyerkolben auf einer rotierenden Plattform 6 Std. bei 37 °C unter schonendem Mischen inkubiert.
- Das Reaktionsgemisch in einen 4 °C heißen Inkubator umfüllen und weitere 12 Stunden unter schonendem Mischen inkubieren.
- Nach der Inkubation das gefärbte Substrat durch Zentrifugation bei 3.000 x g für 30 min ernten. Die Färbelösung aus dem Substratpellet dekantieren.
- Entfernen Sie nicht-kovalent gebundenen löslichen Farbstoff von den Substraten, indem Sie die farbstoffmarkierten Zellen oder das Peptidoglykan wiederholt (ca. 3-5 Wäschen) mit Typ-I-Wasser waschen und anschließend zentrifugieren. Bei jeder Wasserzugabe das Pellet wieder gründlich suspendieren.
Anmerkung: Ungebunden ist der lösliche Farbstoff in der Wasserwäsche nach der Zentrifugation nicht mehr sichtbar. Der Untergrund sollte noch einmal gewaschen werden. Beachten Sie, dass der Untergrund blau bleibt, während der Überstand der letzten Wäsche klar ist.
- Lagern Sie die gefärbten Substrate suspendiert in einer minimalen Menge Wasser bei -20 °C für die spätere Verwendung.
>3. Quantitativer Farbstoff-Freisetzungs-Assay
HINWEIS: Während des Farbstofffreisetzungsassays werden durch die Hydrolyse von RBB-gefärbtem Substrat in der enzymatischen Reaktion gefärbte Produkte in den Reaktionsüberstand freigesetzt. Die kolorimetrische Messung der Menge des freigesetzten Farbstoffs gibt die Menge an enzymatischer Aktivität an, die in der Probe für ein bestimmtes Enzym vorhanden ist. Die quantitative Methode ermöglicht den Vergleich verschiedener Enzyme über Substrate hinweg und ermöglicht die Variation der Umweltbedingungen, die die enzymatische Reaktion beeinflussen (z. B. Temperatur, Salzgehalt und pH-Wert). Das folgende Protokoll beschreibt die Vorbereitung und Durchführung des Farbstofffreisetzungsassays zum quantitativen Nachweis der enzymatischen Aktivität von antimikrobiellen Proteinmitteln.
- Vorbereitung für den Dye-Release Assay
- Lassen Sie das gefrorene gefärbte Substrat wieder auf Raumtemperatur zurückkehren und waschen Sie es zweimal mit Assay-Puffer (phosphatgepufferte Kochsalzlösung, PBS), der für das gegebene Enzym empirisch bestimmt ist.
- Berechnen Sie das Volumen der Substratsuspension, das benötigt wird, indem Sie das Reaktionsvolumen von 200 μl mit der Anzahl der durchzuführenden Farbstofffreisetzungsassays multiplizieren.
- Die Substratsuspension wird durch Zugabe von gefärbtem Substrat zu dem Volumen des Assay-Puffers, bestimmt in 4.1.2, unter Verwendung eines Spektralphotometers hergestellt, bis eine optische Dichte (OD) von 2,0 bei 595 nm erreicht ist. Um innerhalb der Funktionsgrenzen des Spektralphotometers zu bleiben, messen Sie den 2,0 OD595 als 1,0 für eine 1:1-Verdünnung der konzentrierten Lösung. Verwenden Sie den Assay-Puffer als Blindwert.
Anmerkung: Die Substrattrübung für die Reaktion kann über 2,0 angehoben werden, um den Aktivitätsniveaus hocheffizienter Enzyme zu entsprechen.
- Das zu bewertende antimikrobielle Protein wird in einem Assay-Puffer in einer geschätzten Konzentration von 1 mg/ml suspendiert.
- Bestimmen Sie mit dem Mikrotiterplatten-Assay eines Bicinchoninsäure (BCA)-Protein-Assay-Kits gemäß dem Protokoll des Herstellers die tatsächliche Konzentration der zu testenden Proteinprobe. Die Konzentration der Stammsuspension wird unter Verwendung von Assay-Puffer auf 1 mg/ml eingestellt.
- Verwendung des Dye-Release-Assays zur Bestimmung der optimalen Inkubationsbedingungen für ein antimikrobielles Protein
- Die antimikrobielle Stammproteinsuspension auf 100 ng/μl verdünnen. Diese Konzentration ergibt eine endgültige Reaktionsmasse von 1 μg Protein pro Volumen (10 μl), das der Assay-Reaktion zugesetzt wird.
- Bestimmen Sie den thermischen Bereich, der für das bakteriolytische Protein zu beurteilen ist. Der thermische Bereich in diesen Assays umfasste 5 °C, 15 °C, 25 °C, 35 °C, 45 °C, 55 °C und 65 °C.
- Führen Sie die Reaktionsassays in 0,5-ml-Mikrofuge-Röhrchen durch. Für jede thermische Bedingung werden 10 μl des Stammproteins zu 200 μl der vorbereiteten Substratsuspension hinzugefügt.
- Inkubieren Sie 8 Stunden lang in einem Thermocycler, wobei Sie einmal pro Stunde durch Inversion mischen.
- Nach der Inkubation werden die Reaktionen durch Zugabe von 25 μl Ethanol gestoppt.
- Entfernen Sie unverdautes, unlösliches Substrat durch Zentrifugation bei 3.000 x g für 2 min und übertragen Sie 150 μl des Reaktionsüberstands für jedes Reaktionsgemisch auf eine 96-Well-Mikroplatte mit flachem Boden, wobei darauf zu achten ist, dass das Pellet des unverdauten Substrats nicht beschädigt wird.
- Messen Sie die enzymatische Aktivität des antimikrobiellen Proteins für das gegebene Substrat, indem Sie die Menge des löslichen RBB-Farbstoffs bestimmen, der nach der enzymatischen Hydrolyse vom Substrat dissoziiert wird. Um die enzymatische Aktivität zu quantifizieren, messen Sie die Absorption des Überstands bei 595 nm mit einem Mikroplatten-Spektrophotometer. Eine erhöhte Absorption durch den löslichen Farbstoff, der aus dem markierten Substrat in den Überstand abgegeben wird, ist ein quantitatives Maß für die enzymatische Aktivität.
Anmerkung: Die Änderung der Absorption wird durch Aktivitätseinheiten (AU) dargestellt, wobei 1 AU zu einer 0,01-fachen Erhöhung der optischen Dichte des Überstands der Farbstofffreisetzungsreaktion bei 595 nm führt. Eine Blindreaktion, die mit allen Reaktionskomponenten außer dem Enzym inkubiert wird, wird verwendet, um jeden Farbstoff zu subtrahieren, der durch die Inkubation aus dem RBB-markierten Substrat freigesetzt wird. Die optimale enzymatische Temperatur liefert die Messung der Spitzenaktivitätseinheit.