Ein Spot-Plate-Assay zur Bewertung oxidativer Stressreaktionen in Bakterienstämmen

Zusammenfassung

Quelle: Ketelboeter, L. M. et al., Methoden zur Hemmung der bakteriellen Pyomelaninproduktion und zur Bestimmung der entsprechenden Erhöhung der Empfindlichkeit gegenüber oxidativem Stress. J. vis. exp. (2015)

Dieses Video zeigt einen Spot-Plate-Assay, der auf die Bewertung der oxidativen Stressreaktionen von Bakterienstämmen zugeschnitten ist. Einige Stämme produzieren Pyomelanin, ein antioxidatives Pigment. Umgekehrt weisen Stämme, die mit einem Testmittel behandelt wurden, was zu einer verminderten Pyomelaninproduktion führte, eine erhöhte Anfälligkeit für oxidativen Stress auf, was zu einer verminderten Zellviabilität im Vergleich zu Pyomelanin-produzierenden Stämmen führte.

Protokoll

>1. Zubereitung von Nährmedien, Antibiotika und 2-[2-Nitro-4-(trifluormethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexandion (NTBC)

1. Luria-Bertani (LB) Brühe (1 % Trypton, 0,5 % Hefeextrakt, 0,25 % Natriumchlorid, NaCl in H₂O) herstellen und in geeignete Volumina aliquotieren. Im Autoklaven sterilisieren. Bei Raumtemperatur lagern.
2. 100 ml LB-Agar (1 % Trypton, 0,5 % Hefeextrakt, 0,25 % NaCl, 1,5 % Agar in H₂O) in 250-ml-Kolben herstellen. Im Autoklaven sterilisieren und bei Raumtemperatur lagern. Stellen Sie sicher, dass der Agar geschmolzen ist, bevor Sie ihn in Platten gießen.
   Anmerkung: Flaschen mit 100 ml LB-Agar ergeben 4 Platten. Die Menge an LB-Agar kann so verändert werden, dass sie der Anzahl der für den Assay benötigten Platten entspricht.
3. Herstellung von phosphatgepufferter Kochsalzlösung, PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM Kaliumchlorid, KCl, 10 mM Dinatriumhydrogenphosphat, Na2 HPO₄, 2 mM Kaliumdihydrogenphosphat, KH₂PO₄). Sterilisieren Sie im Autoklaven oder bei Filtration und lagern Sie es bei Raumtemperatur.
4. Bereiten Sie die Antibiotika-Stammlösungen für Gentamicin, Kanamycin und Tobramycin vor.
   1. Bereiten Sie geeignete Antibiotika-Stammkonzentrationen für Pseudomonas aeruginosa-Stämme vor, die 100 mg/ml Gentamicin, 30 mg/ml Kanamycin und 10 mg/ml Tobramycin enthalten. Die Antibiotika in Wasser auflösen, filtrieren, sterilisieren (0,2 μm) und bei 4 °C lagern. Ändern Sie die Antibiotika und Konzentrationen je nach untersuchtem Bakterium.

>2. Spot-Platten-Assay für oxidative Stressreaktion

1. Richten Sie über Nacht Kulturen der zu testenden Stämme ein. 2 ml LB-Bouillon in 16 x 150 mm Reagenzgläser (eines pro Stamm) geben und mit 1 isolierten Kolonie aus jedem Stamm impfen. Über Nacht bei 37 °C mit Belüftung auf einem Gewebekulturrotator in einem Luftinkubator inkubieren.
2. Messen Sie den OD₆₀₀ der Übernachtkulturen. Waschen Sie Kulturen, bevor Sie OD_{600-Messungen} vornehmen, um das in den Medien vorhandene Pyomelanin zu eliminieren.
3. Waschen Sie die Kulturen, indem Sie 1 ml Kultur in einer Mikrozentrifuge bei 16.000 x g für 2 Minuten zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand und alle lose pelletierten Zellen mit einer Mikropipette und resuspendieren Sie das feste Zellpellet in 1 ml LB.
4. Bereiten Sie am nächsten Tag LB-Agarplatten vor, die H₂O₂ als oxidativen Stressor enthalten. Ein Bereich von H₂O₂ -Konzentrationen von 0 bis 1 mM ist ein guter Ausgangspunkt.
   1. Die LB-Agarkolben schmelzen. Kühlen Sie das Medium auf ca. 50 °C bei Raumtemperatur ab.
   2. H₂O₂ in den gewünschten Konzentrationen direkt zu dem abgekühlten Medium geben. Kolben zum Mischen schwenken. Siehe Tabelle 1 für die Konzentrationen von H₂O₂ und die Volumina von konzentriertem H₂O 2 für die Zugabe von konzentriertem H 2 O₂. Diese Werte beziehen sich auf 100 ml LB-Agar.
   3. Gießen Sie die Platten sofort nach der Zugabe von H₂O₂ und flammen Sie die Oberfläche ab, um Blasen zu entfernen. Die Ausbeute beträgt 4 Platten pro 100 ml LB-Agar. Markieren Sie die Platten mit der H₂O₂ Konzentration.
   4. Legen Sie die Platten unbedeckt in eine biologische Strömungshaube, während der Lüfter 30 Minuten lang läuft, um überschüssige Feuchtigkeit von den Platten zu entfernen.
      Anmerkung: Verwenden Sie die Platten am selben Tag, an dem sie zubereitet werden. Andernfalls kann es zu inkonsistenten Daten kommen.
      Anmerkung: Oxidative Stressoren wie Paraquat können in diesem Assay durch H₂O₂ ersetzt werden. Die Konzentrationen, die für andere oxidative Stressoren verwendet werden, können sich von denen für H₂O₂ unterscheiden.
5. Waschen und messen Sie den OD₆₀₀ der Nachtkulturen.
6. Normalisieren Sie den OD₆₀₀ aller Übernachtkulturen auf den niedrigsten Wert für die zu testenden Stämme. P. aeruginosa hat im Allgemeinen einen OD₆₀₀ von etwa 2,5, wenn er über Nacht in LB gezüchtet wird.
   1. Bestimmen Sie das Kulturvolumen, das erforderlich ist, um die Kultur auf den niedrigsten OD₆₀₀ in einem Gesamtvolumen von 1 ml zu verdünnen. Wenn eine Kultur z. B. einen OD₆₀₀ von 3 aufweist und der niedrigste OD₆₀₀ für den Satz von Stämmen 2,5 beträgt, führen Sie die folgende Berechnung durch: (2,5)(1 ml) = (3)(x). x = 0,833 ml. 0,833 ml Kultur werden in ein Mikrofuge-Röhrchen gegeben.
   2. Berechnen Sie die Menge an LB + DMSO, die benötigt wird, um das Kulturvolumen auf 1 ml zu bringen. Für das Beispiel in Schritt 4.4.1 beträgt die Menge an LB + DMSO, die der Kultur zugesetzt wird, 0,167 ml (1 ml Gesamtvolumen – 0,833 ml Kultur). Herstellung von Stammlösungen aus LB + DMSO, die für diese Verdünnungen verwendet werden, basierend auf dem Volumen, das für die Verdünnung aller Stämme benötigt wird.
   3. Mischen Sie die Kultur und LB + DMSO durch Vortexen.
7. Um die Kulturen in einer konstanten DMSO-Konzentration zu halten, führen Sie zehnfache serielle Verdünnungen der normierten Übernachtkulturen in PBS + DMSO durch.
   1. Erstellen Sie eine Stammlösung aus PBS + DMSO. Mischen Sie für einen Verdünnungssatz für einen Stamm 300 μM Volumen DMSO mit PBS, um ein Gesamtvolumen von 720 μl zu erhalten. Skalieren Sie diese Bestände nach oben oder unten, je nachdem, wie viele Stämme getestet werden.
   2. Markierung von Mikrofugenröhrchen für ^10-1 bis ^10-7 serielle Verdünnungen. Geben Sie 90 μl PBS + DMSO in die entsprechenden Röhrchen. Verwende PBS + DMSO für Stämme, die in LB + DMSO angebaut werden.
   3. 10 μl Kultur in das entsprechende 10-1-Verdünnungsröhrchen geben. Mischen Sie durch Vortexen und geben Sie 10 μl der ^{10-1-Verdünnung} in das 10-2-Verdünnungsröhrchen. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Verdünnungen durchgeführt wurden. Wechseln Sie die Pipettenspitzen zwischen den Verdünnungen.
8. 5 μl der Verdünnungen ^10-3 bis ^10-7 auf LB + H₂O₂ Platten in doppelter Ausführung für jeden Stamm aufbringen. Verwenden Sie eine Pipettenspitze, wenn die Flecken von der stärksten Verdünnung zur geringsten Verdünnung (^10-7 bis ^10-3) plattiert sind. Kippen oder kippen Sie die Platte nicht, bis die Flüssigkeit in der Platte getrocknet ist.
9. Die Platten je nach Stamm 24-48 Std. bei 37 °C (Luftinkubator) inkubieren.
   HINWEIS: P. aeruginosa PAO1 hat nach 24 Stunden Inkubation gut große Kolonien auf LB. Inkubieren Sie Stämme, bis sie Kolonien haben, die ungefähr die gleiche Größe wie PAO1 haben.
10. Fotografieren Sie die Platten mit einer CCD-Kamera über einem Transluminator. Optional können Sie die Fotos für den Kontrast bearbeiten und auf die gleiche Größe zuschneiden. Zählen Sie die Anzahl der Kolonien an jeder Stelle, um Veränderungen in der Empfindlichkeit gegenüber oxidativem Stress zu bestimmen.

Tabelle 1: Konzentrationen von H₂O₂ zur Zugabe zum LB-Agar für den oxidativen Stress-Spot-Platten-Assay. Diese Tabelle zeigt verschiedene H₂O₂ -Konzentrationen und die entsprechende Menge an konzentriertem H₂O₂ -Stamm zur Zugabe zu 100 ml LB-Agar.

kg kg kg kg kg kg kg kg Uhr

Endkonzentration von H2O2 (mM)	Menge von 9,79 M H2O2 (30 Gew.-%) zu addieren (μl)
0	0
0,2	2,04
0,4	4,09
0,6	6,13
0,8	8,17
1	10.21

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
2-[2-Nitro-4-(trifluormethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexandion (NTBC)	Sigma-Aldrich	SML0269-50mg	Auch Nitisinon genannt. Löslich in DMSO.
H2O2	Sigma-Aldrich	Artikel-Nr.: 216763-100ML	30 Gew.-% in H2O. Stabilisiert.