>1. Bakterienstamm und Wachstumsmedium
- Stellen Sie Albumin-Dextrose und Salz-Stammlösung (ADS) her, indem Sie 25 g Rinderserumalbumin, 10,0 g Dextrose und 4,05 g Natriumchlorid in 460 ml entionisiertem Wasser solubilisieren. Sterilisieren Sie das ADS und lagern Sie es bei 4 °C.
- Stellen Sie 7H9-Brühe her, indem Sie 4,7 g 7H9-Pulver und 2 ml Glycerin zu 900 ml gereinigtem Wasser hinzufügen. Autoklavieren Sie die 7H9-Brühe 10 Minuten lang bei 121 °C und lassen Sie sie auf Raumtemperatur abkühlen, bevor Sie fortfahren. Stellen Sie 7H9ADST her, indem Sie 100 ml ADS und 0,5 ml Tween80 bis 900 ml 7H9-Brühe hinzufügen. Bei 4 °C lagern.
- Wiegen Sie 50 mg Kanamycinsulfat und lösen Sie es in 1 ml deionisiertem Wasser auf; die Endkonzentration beträgt 50 mg/ml. Sterilisieren und bei -20 °C lagern. 0,5 ml Kanamycin-Stammlösung pro 1 l 7H9ADST zugeben.
Anmerkung: Dieses Medium sollte frisch hergestellt werden, skalieren Sie also die Volumina entsprechend der Kulturgröße.
- Züchten Sie M. tuberculosis in 7H9ADST, ergänzt mit Kanamycin in stehender Kultur. Schütteln Sie die Kultur täglich und verdünnen Sie sie, bevor der OD600 1,0 erreicht, um ein Verklumpen zu vermeiden.
Anmerkung: Der M. tuberculosis-Stamm, der für die Entwicklung dieser Methode verwendet wurde, war H37Rv, transformiert mit dem Plasmid pJAK2.A. pJAK2.A ist ein integratives Plasmid auf Basis des pMV361-Vektors, das eine hochgradige Expression des Glühwürmchen-Luciferase-Gens aus dem hsp60-Promotor ermöglicht und mit Kanamycin selektiert werden kann.
>2. Analyse der Aktivität in der Brühe mit einem Resazurin-Assay
- Züchten Sie M. tuberculosis in 7H9ADST bis zur mittleren logarithmischen Phase (~ 0,5 - 0,8 OD600). Verdünnen Sie die Kultur mit dem 7H9ADST auf 0,01 OD600. Verdünnen Sie die Verbindungen in 7H9ADST auf das 2-fache der Testkonzentrationen und aliquotieren Sie 100 μl jeder verdünnten Verbindung in jede Vertiefung.
- Übertragen Sie 100 μl der verdünnten Bakteriensuspension in jede Vertiefung. Lassen Sie die Platten bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator 5 Tage lang inkubieren. Löse 10 mg Resazurin in 100 ml entionisiertem Wasser und einem Sterilfilter auf.
- Geben Sie 30 μl Resazurin-Lösung hinzu und überwachen Sie die Farbveränderung nach 48 h; das Bakterienwachstum wird durch eine Farbumwandlung von Blau zu Rosa angezeigt.
Anmerkung: Eine quantitative Analyse kann auch durchgeführt werden, indem entweder die Fluoreszenz bei 590 nm mit Anregung bei 530 - 560 nm oder die Extinktion bei 570 nm und 600 nm gemessen wird.
