Messung der TEER in röntgenbestrahlten Epithelzellen, die mit PBMCs kokultiviert wurden

Zusammenfassung

Quelle: Babini, G., et al. Eine Co-Kulturmethode zur Untersuchung der Wechselwirkung zwischen röntgenbestrahlten Caco-2-Zellen und PBMC. J. Vis. Exp. (2018)

Dieses Video zeigt die Messung des transepithelialen elektrischen Widerstands in bestrahlten Caco-2-Zellen, sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit von PBMC-Zellen. Diese Methode ermöglicht es, die synergistischen Effekte von Strahlungs- und Immunzellen auf die Epithelzellbarriere zu untersuchen.

Protokoll

>1. Aufbau der Bestrahlung

Hinweis: Die Bestrahlung von Caco-2-Zellen wurde in der Strahlentherapie-Abteilung des Istituto di Ricovero e Cura a Carattere Scientifico (IRCCS) S. Maugeri (Pavia, Italien) mit einem Linearbeschleuniger durchgeführt, der routinemäßig zur Behandlung verschiedener Krebsarten eingesetzt wird.

1. Stellen Sie die Röntgenenergie der Photonen auf 6 MV Spitze ein. Der Linearbeschleuniger arbeitet in einem pulsierenden Regime (Zeit zwischen zwei aufeinanderfolgenden Impulsen ca. 4 ms; Dauer eines einzelnen Impulses ca. 5 μs bei einer Dosisleistung von bis zu 1 × ^10-3 Gy/p).
2. Die 6-Well-Platten mit Einsätzen mit Caco-2 werden auf der Röntgenbahn auf einer 1,4 cm dicken Plexiglasscheibe (entsprechend einem Abstand, der etwas größer ist als der Aufbau der verwendeten Strahlung) in einem Abstand von 100 cm von der Strahlungsquelle platziert.
3. Platzieren Sie vor der Bestrahlung einen 0,5 cm dicken Bolus auf jede Probe, um die rückgestreute Strahlungskomponente und das Gleichgewicht der geladenen Teilchen zu gewährleisten.
4. Bestrahlen Sie die Zellen (Dosen im Bereich von 2 - 10 Gy) mit einem flachen und symmetrischen (± 2%) Strahlungsfeld von 20 x 20 cm₂ und einer Dosisleistung von 3 Gy/min.
   Anmerkung: Kontrollzellen mit "schein"-Bestrahlung durchliefen die gleichen Verfahrensbedingungen wie die bestrahlten, ohne den Bestrahlungsraum zu betreten (erhaltene Dosis: 0 Gy).
   Vorsicht: Geräte zur Erzeugung ionisierender Strahlung dürfen nur von Fachpersonal verwendet werden.

>2. Transepithelialer elektrischer Widerstand (TEER)

1. 5 × 10⁵ Caco-2-Zellen eine Woche vor der Bestrahlung in 6-Well-Platten-Co-Kultureinsätzen (Polyethylenterephthalat (PET), 2 x 10⁶ Poren/cm2) aussäen.
2. 1 h vor der Bestrahlung den TEER mit einem Voltmeter/Ohmmeter messen.
3. Bestrahlen Sie die Zellen wie in den Schritten 1.1 - 1.4 beschrieben.
4. Caco-2-Zellen in Gegenwart/Abwesenheit von Co-Kultur mit PBMC bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO₂ inkubieren.
5. Messen Sie den TEER in den ersten Stunden nach der Bestrahlung stündlich und anschließend alle 3 Stunden bis zu 48 Stunden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
ThinCert 6-Well-Zellkultureinsätze für Multiwell-Platten	Greiner Bio-one	Artikel-Nr.: 657610	Ausrüstung
Zellkultur-Multiwell-Platte, 6 Well	Greiner Bio-one	Artikel-Nr.: 657160	Plastik
Zellkultur-Multiwell-Platte, 24 Well	Greiner Bio-one	Artikel-Nr.: 662160	Plastik
RPMI 1640 ohne L-Glutamin	Lonza	12-167F	reagenzien
Millicell-ERS Voltmeter/Ohmeter	Millipore	MERS 00001	Ausrüstung