>1. Initiierung von Biofilmen
- Züchten Sie eine Kultur von Biofilm-produzierenden Organismen in einem nährstoffreichen Medium. Staphylococcus aureus Stamm Newman in 10 ml Mueller-Hinton-Medium aus einem Glycerinstock impfen. Führen Sie alle Arbeiten, die mit dem Umgang mit S. aureus verbunden sind, mit Handschuhen und in einer Biosicherheitswerkbank durch.
- 16 Stunden bei 37 °C auf einem Rotationsschüttler (100-200 U/min) inkubieren.
- Bestimmen Sie OD600 der Kultur mit einem Spektralphotometer und einer Standardküvette (Weglänge: 1 cm).
- Berechnen Sie das Kulturvolumen (V), das benötigt wird, um 20 ml Inokulum mit OD600 (Inokulum) von 0,1 in chelexierten Medien des Roswell Park Memorial Institute (CRPMI) herzustellen, indem Sie die Formel verwenden: [V = 20 ml*0,1/OD600 (Kultur)].
- Geben Sie das berechnete Kulturvolumen (von oben) in ein Zentrifugenröhrchen und Pelletzellen, indem Sie es 1 Minute lang bei 10.000 x g drehen. Um das Biofilm-Inokulum vorzubereiten, aspirieren Sie das verbrauchte Wachstumsmedium und resuspendieren Sie das Zellpellet in 20 ml CRPMI.
- Gießen Sie das Inokulum in ein 25-ml-Reservoir.
- Entfernen Sie vorsichtig den Deckel von einer sterilen 96-Well-Stiftplatte, indem Sie ihn gerade nach oben ziehen.
Hinweis: Es ist darauf zu achten, dass die vom Deckel herabhängenden Heringe nicht verunreinigt werden. Der Deckel kann kopfüber auf eine saubere Oberfläche innerhalb einer Biosicherheitswerkbank gelegt werden.
- Geben Sie mit einer 200-μl-Mehrkanalpipette 125 μl Inokulum in jede Vertiefung der Reihen A bis G der Bodenplatte.
- Zur Sterilitätskontrolle werden 125 μl steriles CRPMI-Medium in jede Vertiefung der Reihe H eingefüllt.
- Nehmen Sie den Wirbeldeckel und halten Sie ihn mit den Stiften nach unten über den Plattenboden. Richten Sie die einzelnen Heringe vorsichtig an den jeweiligen Vertiefungen aus. Vermeiden Sie physischen Kontakt zwischen der Platte und den Stiften. Sobald Sie ihn ausgerichtet haben, senken Sie den Deckel vorsichtig nach unten. Fehlausrichtungen sind zu vermeiden, da Nachjustierungen, die nach dem Auftreffen der Stifte auf der Bodenplatte durchgeführt werden, die Sterilitätskontrollen in Reihe H kontaminieren können.
- Verschließen Sie den Deckel mit Paraffinfolie auf der Platte, um eine Verdunstung zu verhindern, und legen Sie ihn fest in eine verschließbare Plastiktüte. Halten Sie das Luftvolumen im Beutel so gering wie möglich, um die Verdunstung zu minimieren.
- Ohne Schütteln bei 37 °C für 48 Std. in einem 5 % CO2 -Inkubator inkubieren.
Hinweis: 48 Stunden Wachstum waren für S. aureus optimal, variieren jedoch je nach verwendetem Organismus.
Anmerkung: Obwohl die statische Inkubation ein guter Ausgangspunkt für die Optimierung des Assays ist, ist das sanfte Schütteln bei 150 U/min auf einem Mikrotiterplattenschüttler eine mögliche Variante, die die Biofilmbildung einiger S. aureus-Isolate verbessern kann.
>2. Vorbereitung der Biofilm-Herausforderungsplatte
- Nehmen Sie am Tag der Biofilm-Challenge eine frische 96-Well-Platte und geben Sie 100 μl CRPMI, äquilibriert zur RT, in jede Vertiefung der Reihen B bis H. Um inkonsistente Ergebnisse zu vermeiden, verwenden Sie eine 96-Well-Platte, die 200 μl Medium aufnehmen kann, wenn sich die Stifte im Inneren befinden, und über Vertiefungen verfügt, deren Abmessungen mit denen der Biofilm-Initiationsplatte identisch sind.
- Bis zu 4 Testverbindungen werden separat in 1,0 ml CRPMI auf das 2-fache der gewünschten Endkonzentration verdünnt, um eine endgültige Verdünnung in Schritt 2.7.
zu berücksichtigen.
Hinweis: Ein guter Ausgangspunkt liegt 8-fach über der hemmenden Konzentration von Planktonzellen.
- 200 μl der Verbindung 1 in den Vertiefungen A1 bis A3, der Verbindung 2 in den Vertiefungen A4 bis A6, der Verbindung 3 in den Vertiefungen A7 bis A9 und der Verbindung 4 in den Vertiefungen A10 bis A12 zugeben.
- Die Testverbindungen werden mit einer Mehrkanalpipette seriell verdünnt und 100 μl von Reihe A nach Reihe B übertragen und gemischt.
- Auf diese Weise werden weiterhin 100 μl von gut zu gut übertragen. Nach jedem Transfer mischen und in Reihe F aufhören.
- Nach dem Mischen 100 μl aus Reihe F in einen Abfallbehälter ausstoßen. Füllen Sie keine Flüssigkeit in die Reihen G und H um.
- Geben Sie 100 μl CRPMI mit einer Mehrkanalpipette in jede Vertiefung der Platte, um das Volumen auf 200 μl zu bringen. In Abbildung 1 finden Sie das endgültige Plattenlayout.
>3. Biofilm-Herausforderung
- Geben Sie 200 μl phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) in eine frische sterile 96-Well-Platte, deren Vertiefungen mit den Abmessungen der Biofilm-Initiationsplatte identisch sind.
- Entfernen Sie die Plastiktüte und die Paraffinfolie von der inkubierten Biofilm-Initiationsplatte.
- Hebe den Deckel gerade nach oben. Vermeiden Sie den Kontakt zwischen den Stiften und dem Plattenboden, da dies den Biofilm beschädigen kann. Bewahren Sie den unteren Teil für die spätere Analyse des OD600 auf (siehe 3.8).
- Spülen Sie die planktonischen Zellen ab, indem Sie den Stiftdeckel auf die PBS-Platte legen (aus Schritt 3.1). Tauchen Sie die Stifte 5 Sekunden lang ein, heben Sie sie aus PBS heraus und tauchen Sie erneut ein, wobei Sie darauf achten müssen, dass die Stifte nicht gegen die Vertiefungsseiten stoßen.
- Setzen Sie den gespülten Stiftdeckel in die Herausforderungsplatte ein. Vermeiden Sie unnötigen Kontakt zwischen Stiften und Bodenplatte, da dies den Biofilm beschädigt und zu inkonsistenten Ergebnissen führt.
- Verschließen Sie die Platte mit Paraffinfolie und legen Sie sie in eine verschließbare Plastiktüte, wie in Schritt 1.10 beschrieben.
- Die Platte wird 24 Stunden lang bei 37 °C in einem Inkubator mit 5 % CO2 ohne Schütteln inkubiert.
- Nehmen Sie die Unterseite der Biofilm-Initiationsplatte von 3.3. Resuspendieren Sie die Bakterien in jeder Vertiefung mit einer Mehrkanalpipette und messen Sie den OD600 mit einem geeigneten Mikroplatten-Reader, um das Wachstum in allen Vertiefungen mit Ausnahme der Sterilitätskontrollen in Reihe H zu bestätigen.
>4. Bestimmung von Biofilmen
- Verwenden Sie ein Plattenlesegerät, das mit einer Inkubationskammer ausgestattet ist und kinetische Fluoreszenzmessungen zum Nachweis der Resazurin-Umwandlung durchführen kann. Richten Sie eine 24-Stunden-Messung der kinetischen Fluoreszenz mit einer Anregung von 530 nm und einer Emission von 590 nm ein.
- Stellen Sie die Kammertemperatur auf 37 °C ein und lassen Sie die Platte alle 20 Minuten ablesen. Stellen Sie den Plattenleser so ein, dass er gemäß den Anweisungen des Herstellers von der Unterseite der Platte aus misst.
- Bereiten Sie die Waschplatte vor, indem Sie 200 μl PBS mit einer Mehrkanalpipette auf eine sterile 96-Well-Platte geben.
- Bereiten Sie das Biofilm-Rückgewinnungsmedium vor, indem Sie 400 μl 0,8 mg/ml Resazurin-Stammlösung zu 20 ml CRPMI-Medium bis zu einer Endkonzentration von 16 μg/ml Resazurin.
Anmerkung: Resazurin ist ein bekannter Hautreizstoff. Verwenden Sie bei der Handhabung einen Laborkittel, eine Spritzschutzbrille und Handschuhe. CRPMI als Biofilm-Rückgewinnungsmedium wurde verwendet, da es das geringste Hintergrundsignal liefert, aber es kann gegebenenfalls durch Mueller-Hinton-Medien ersetzt werden.
- Geben Sie 150 μl Biofilm-Rückgewinnungsmedium mit einer Mehrkanalpipette in jede Vertiefung einer frischen 96-Well-Platte.
- Bringen Sie die Challenge Plate aus dem Inkubator in eine Biosicherheitswerkbank und entfernen Sie vorsichtig die Plastiktüte und die Siegelfolie.
- Entfernen Sie den Stiftdeckel von der Challenge-Platte und spülen Sie die Planktonzellen in PBS ab, wie in 3.4 beschrieben. Bewahren Sie die Unterseite der Herausforderungsplatte für die anschließende Analyse des OD600 auf (siehe 4.10).
- Setzen Sie nach dem Spülen den Stiftdeckel in den Plattenboden ein, der das Biofilm-Rückgewinnungsmedium enthält.
- Wickeln Sie die Seite der Platte mit Paraffinfolie ein und achten Sie darauf, den Boden der umlaufenden Vertiefungen nicht zu blockieren. Legen Sie die Platte unmittelbar nach dem Einwickeln auf den Plattenleser und starten Sie einen kinetischen Test über einen Zeitraum von 24 Stunden, indem Sie das zuvor erstellte kinetische Resazurin-Protokoll aus Schritt 4.1 starten.
- Um das Wachstum von Planktonzellen zu quantifizieren, das während der Challenge auftreten kann oder auch nicht, lesen Sie den OD600 des gesamten Challenge-Plate-Bodens mit einem Mikroplatten-Reader ab. Befolgen Sie die Anweisungen in Schritt 3.8.
Hinweis: Suspendieren Sie den Inhalt jeder Vertiefung vorsichtig, da Zellen, die den Biofilm abstoßen, dazu neigen, in Klumpen am Boden der Vertiefung zu wachsen. Blasen in der Vertiefung beeinträchtigen die Messwerte von OD600 stark und müssen vor der Ablesung vermieden oder entfernt werden.
