>1. Vorbereitung
- Zellen-Beschichtung
Anmerkung: In diesem Protokoll wurden humane zervikale Epithelzellen, HeLa und HeLa, die Histon 2B-GFP (H2B-GFP) exprimieren, verwendet, aber dieser Assay kann an andere Säugetierzellen angepasst werden.
- Lösen Sie adhärente Zellen aus einem 75 cm großen 2-Zell-Kulturkolben, indem Sie die Zellen mit 2 ml Trypsin-EDTA 0,25% waschen. Ersetzen Sie das gebrauchte Trypsin durch 2 ml frisches Trypsin-EDTA 0,25%.
- Die Zellen werden 5 Minuten lang bei 37 °C inkubiert, bis sich die Zellen gerundet und vom Kolben gelöst haben.
- Resuspendieren Sie die Zellen in 8 ml Wachstumsmedium (DMEM enthält 10 % hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum, 100 μg/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin).
- Bestimmen Sie die Zellkonzentration mit einem Hämozytometer und 10 μl Zellsuspension.
- Verdünnen Sie die Zellen in einem Wachstumsmedium auf eine Konzentration von 2,5 x 105 Zellen/ml.
- Gießen Sie die Zellsuspension in ein steriles Pipettenbecken und mischen Sie die Suspension gründlich mit einer serologischen 10-ml-Pipette.
- Mit einer 12-Kanal-Mikropipette und 200-μl-Spitzen werden HeLa-Zellen (2,5 x 104 Zellen/100 μl/Well) in dreifacher (oder vierfacher) Ausfertigung in einer flachen, schwarzen Polystyrol-Gewebekultur-behandelten 96-Well-Platte mit klarem Boden verteilt
Anmerkung: Eine Beschichtungsanordnung ist in Abbildung 1 als Beispiel dargestellt.
- Kultivieren Sie die Zellen 24 h lang in einem befeuchteten Zellkultur-Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2
.
- Vorbereitung der Stammlösung
- Bereiten Sie 1 l einer 10-fachen Brühe Puffer M (zur Herstellung von M1 und M2) vor, indem Sie 95 g Hanks Balanced Salt Solution, 0,476 g MgCl2 (5 mM) und 23,83 g HEPES (100 mM) zu 900 mL Wasser hinzufügen. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein und erhöhen Sie das Volumen auf 1 l. Filter sterilisieren.
- Bereiten Sie 50 ml einer 50x (1,25 M) Brühe Glukose vor, indem Sie 11,26 g D-(+)-Glukose zu insgesamt 50 ml Wasser hinzufügen. Filter sterilisieren die Lösung.
- Bereiten Sie 50 ml eines 100-fachen (120 mM) Vorrats an Kalzium vor, indem Sie 0,666 g CaCl2 zu insgesamt 50 ml Wasser hinzufügen. Filter sterilisieren die Lösung.
- Bereiten Sie 50 ml einer 10-fachen (50 mM) Brühe Ethylenglykol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N', Tetraessigsäure (EGTA) vor, indem Sie 0,951 g EGTA zu 40 mL Wasser hinzufügen. Erhöhen Sie den pH-Wert auf 8 mit NaOH, um das EGTA aufzulösen, und erhöhen Sie dann das Volumen auf 50 ml. Filter sterilisieren die Lösung.
- Bereiten Sie für eine einzelne 96-Well-Platte 50 mL Medium 1 (M1, enthält Ca2+), 50 mL Medium 2 (M2, Ca2+-frei) und 15 mL Medium 2 mit EGTA entsprechend vor:
- Für M1 fügen Sie 5 ml 10x Puffer M, 0,5 ml 100x CaCl2 und 1 ml 50x Glukose zu 43,5 ml Wasser hinzu.
- Für M2 fügen Sie 5 mL 10x Buffer M und 1 mL 50x Glukose zu 44 mL Wasser hinzu.
- Für M2/EGTA 1,5 mL 10x Buffer M und 1,5 mL 10x EGTA auf 12 mL Wasser geben.
Anmerkung: Alle Lösungen, die Propidiumiodid (PI) enthalten, sollten unmittelbar vor der Zugabe zu den Zellen hergestellt werden.
- Einstellungen für Plattenleser/bildgebende Zytometer
Anmerkung: Verwenden Sie ein Multimode-Plattenlesegerät, das mit zwei Detektionseinheiten ausgestattet ist: einem Spektrofluorometer und einem bildgebenden Zytometer. Begrenzen Sie die Fluoreszenzbelastung, um ein Photobleichen der Fluorophore zu vermeiden.
- Erwärmen Sie den Plattenleser auf 37 °C, bevor Sie den Assay durchführen.
- Richten Sie die Parameter für den kinetischen Assay im Einstellungsmodus entsprechend ein:
- Wählen Sie Monochromator, FL (Fluoreszenz) und Kinetisch für die optische Konfiguration, die Lesemodi bzw. den Lesetyp.
- Wählen Sie unter Wellenlängeneinstellungen einen Anregungs- bzw. Emissionsbandpass von 9 nm bzw. 15 nm aus. Für Assays mit Propidiumiodid (PI) stellen Sie die Anregungs- und Emissionswellenlängen auf 535 bzw. 617 nm ein.
- Wählen Sie unter Plattentyp die Option 96 Wells für das Plattenformat und eine voreingestellte Plattenkonfiguration aus, die einer klaren Bodenplatte mit schwarzer Wand entspricht.
- Markieren Sie unter Lesebereich die Wells, die während der gesamten Kinetik analysiert werden.
- Stellen Sie unter PMT und Optik die Blitze pro Lesevorgang auf 6 vor und aktivieren Sie das Kontrollkästchen für Von unten lesen.
- Geben Sie unter Timing 00:30:00 in das Feld Gesamtlaufzeit für einen 30-minütigen kinetischen Assay ein, und geben Sie 00:05:00 für das Intervall ein.
Hinweis: Für jeden Zeitpunkt und jede Wellenlänge beträgt die Lesezeit einer vollen 96-Well-Platte 30 s.
- Bestätigen Sie die in den Einstellungsinformationen auf der rechten Seite angegebenen Einstellungen und wählen Sie OK. Drücken Sie Lesen, um den kinetischen Lauf zu starten.
- Richten Sie die Imaging-Parameter im Einstellungsmodus entsprechend ein:
- Wählen Sie Minimax, Imaging und Endpoint für die optische Konfiguration, die Lesemodi bzw. den Lesetyp aus.
- Wählen Sie unter Wellenlängen die Option Durchlicht und eines oder beide Fluoreszenzfelder aus, die den Anregungs- und Emissionswellenlängen von 456/541 nm (GFP) und 625/713 nm (PI) entsprechen.
- Verwenden Sie die gleichen Optionen für den Plattentyp und den Lesebereich, die in den Schritten 1.3.2.3 und 1.3.2.4 definiert sind.
- Wählen Sie unter Einstellung des Bohrlochbereichs die Anzahl der Stellen innerhalb eines Bohrlochs aus, die abgebildet werden sollen.
Hinweis: 12 Stellen entsprechen einem Full-Well-Bild.
- Wählen Sie in den Bildaufnahmeeinstellungen die Belichtungszeiten für Durchlicht, 541 (GFP) und 713 (PI) aus. Bei GFP wird das gesamte Well mit einer Belichtungszeit von 20 ms/Bild abgebildet. Für Durchlicht (TL) und PI-Fluoreszenz wird ein einzelnes Bild des Zentrums jeder Vertiefung mit Belichtungszeiten von 8 bzw. 20 ms aufgenommen.
- Bestätigen Sie die in den Einstellungsinformationen auf der rechten Seite angegebenen Einstellungen und wählen Sie OK. Die Erfassungszeit für die Abbildung der gesamten Oberfläche jedes Wells (12 Bilder/Well) einer 96-Well-Platte und für eine Wellenlänge beträgt ~15 min. Drücken Sie Lesen, um die Bildgebung zu starten.
Hinweis: Die Erfassungszeit eines einzelnen Bildes/Wells einer 96-Well-Platte erfordert ~2,5 min/Platte für eine Wellenlänge. Die oben beschriebenen Parameter entsprechen der spezifischen Ausstattung in unserem Labor. Spektrofluorometrische Messungen: Eine Xenon-Blitzlampe mit Anregungswellenlängen in Schritten von 1,0 nm (250-850 nm) mit einem einstellbaren 9- oder 15-nm-Bandpass, ein Photomultiplier-Röhrendetektor mit einem Dynamikbereich von > 6 log und einem einstellbaren Emissionsbandpass von 15 oder 25 nm. Bildgebendes Zytometer: Eine Beleuchtungslichtquelle, die weißes Licht, Anregungswellenlängen von 460 nm und 625 nm mit einem 20-nm-Bandpass, Emissionsfiltern, die bei 541 nm (108 nm Bandpass) bzw. 713 nm (123 nm Bandpass) zentriert sind, und ein 4X-Objektiv, das mit einer ladungsgekoppelten 12-Bit-12-Bit-Gerätekamera von 1,25 Megapixeln gekoppelt ist.
>2. Assay
Hinweis: Zum Zeitpunkt des Assays müssen die Zellen zu 70-90% konfluent sein. Während der Waschschritte sollte das Medium aus der Seitenwand der Vertiefung (nicht direkt über den Zellen) entfernt und auf diese aufgetragen werden. Die Temperatur von LLO wird bis Schritt 3.1.5 auf < 4 °C gehalten, um eine Aggregation zu verhindern.
- Es wird eine Brühe von 30 μM PI in M1 und eine Brühe von 30 μM PI in M2 hergestellt, die bei 37 °C vorgewärmt wird.
- Waschen Sie die Zellen in Platte 1 vorsichtig mit einer 12-Mehrkanal-Mikropipette und 200-μl-Spitzen wie folgt:
- Entfernen Sie bei reparaturfreundlichen Bedingungen das Wachstumsmedium und waschen Sie die Zellen zweimal mit 200 μl/Vertiefung M1, das auf 37 °C vorgewärmt wurde. Ersetzen Sie das Medium durch 100 μl/Vertiefung warmes M1 mit 30 μM PI.
- Für reparaturrestriktive Bedingungen entfernen Sie das Wachstumsmedium und waschen Sie die Zellen einmal mit 200 μl/Well warmem M2 mit 5 mM EGTA zu Chelat Ca2+, gefolgt von einer Wäsche mit 200 μl/Well M2. Ersetzen Sie das Medium durch 100 μL/gut warmes M2 mit 30 μM PI.
- Nachdem das Wachstumsmedium gewaschen und durch ein propidiumiodidhaltiges Medium ersetzt wurde, fahren Sie direkt mit Schritt 2.1.3 fort.
- Bildplatte 1 unter Durchlicht, GFP und PI, wie in Abschnitt 1.3.3 (präkinetisch) beschrieben. Dieser Schritt dauert ca. 15-20 min.
- Während des Zeitraums von 15 Minuten in Schritt 2.1.3 wird Platte 2 mit einer 12-Mehrkanal-Mikropipette und 200-μl-Spitzen wie folgt vorbereitet:
- Lege eine 96-Well-Mikroplatte aus Polypropylen mit rundem Boden auf Eis. Konfigurieren Sie die Platte mit einem experimentellen Versuchsplan, der Platte 1 entspricht (Abbildung 1).
- Für reparaturpermissive Bedingungen 100 μl/Vertiefung eiskaltes M1 mit 60 μM PI hinzufügen, gefolgt von der Zugabe von 100 μl/Vertiefung eiskaltem M1 mit 4x LLO oder nicht für die Kontrolle.
- Für reparaturrestriktive Bedingungen fügen Sie 100 μl/Vertiefung eiskaltes M2 mit 60 μM PI hinzu, gefolgt von der Zugabe von 100 μl/Vertiefung eiskaltem M2 mit 4x LLO oder nicht für die Kontrolle.
- Legen Sie die Speicherfolie 1 (Schritt 2.1.3) sofort auf Eis und verwenden Sie Aluminiumfolie, um die Platte vom direkten Kontakt mit Eis zu trennen. Teller 1 5 min abkühlen lassen.
- Mit einer 12-Mehrkanal-Mikropipette und 200-μl-Spitzen werden 100 μl aus jeder Vertiefung in Platte 2 (Schritt 2.1.4) in die entsprechenden Vertiefungen in der Platte 1 übertragen. Um das Toxin richtig in den Medien von Platte 1 zu verteilen, führen Sie die Spitzen unterhalb des Meniskus ein und werfen Sie das Volumen vorsichtig aus, ohne Blasen zu bilden.
Hinweis: Pipettieren Sie nicht auf und ab, da sich die Zellen dadurch versehentlich ablösen können.
- Lassen Sie die Platte weitere 1 Minute stehen, damit das Toxin an die Zellen binden kann, und übertragen Sie Platte 1 sofort auf den Plattenreader für den kinetischen Assay im Spektrofluorometer-Modus (Schritt 1.3.2).
- Am Ende des kinetischen Assays ist sofort die Platte 1 (postkinetisch) unter Verwendung von Schritt 1.3.3 abzubilden.
>3. Analyse: Aufzählung von Zellen
- Bestimmen Sie die Zellzahl basierend auf der Kernfluoreszenz mit der Mikroplatten-Zellzählsoftware.
- Wählen Sie in den Einstellungen die Option Erneute Analyse und im Kategoriebereich in den Bildanalyseeinstellungen die Option Diskrete Objektanalyse mit 541 als Wellenlänge für die Suche nach Objekten aus.
- Wählen Sie in der Option "Objekte suchen" mit der Suchmethode "Auf Bildern zeichnen" auf der Registerkarte "Einstellungen" die Option "Kerne" aus und drücken Sie "Anwenden".
- Drücken Sie OK und Lesen, um den Algorithmus für die Zellzählung zu starten.
