Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
>1. Formalinfixierung von Geweben
- Legen Sie 3-5 mm Hirngewebe, das nach der Autopsie gesammelt wurde, in 10%ige phosphatgepufferte Formalinlösung (1:20 bis 1:50 Gewebe/Formalin-Verhältnis) für 24-72 h.
Vorsicht: Formalin ist ein giftiges Fixiermittel.
- Notieren Sie das ungefähre Gewebegewicht (Größe), den Gewebetyp (Hirnareale) und das Volumen des Formalins. Für Labore ist es wichtig, die Fixationszeiten zu dokumentieren und zu protokollieren.
- Für eine längere Gewebelagerung nach der Formalinfixierung und vor der Verarbeitung legen Sie das Gewebe in 70%iges Ethanol.
>2. Gewebeverarbeitung
- Nach der Probenfixierung wird das Gewebe präpariert, um die wichtigen Hirnareale einzubeziehen, z. B. Querschnitte des Hirnstamms, des Kleinhirns (3 Lappen) oder des Hippocampus (beide Hippocampus), die jeweils 3 bis 5 mm dick geschnitten und in Verarbeitungskassetten eingelegt werden.
- Verarbeiten Sie die Gewebekassetten für die Paraffinwachsinfiltration, die in Paraffinblöcke eingebettet und auf einem Mikrotom geschnitten (3 bis 6 μm) sind.
>3. Vorbereitung von Materialien / Färben von Schalen
- Richten Sie die Färbeschale (Materialtabelle) wie in Abbildung 1 gezeigt ein. Füllen Sie jede Schale mit 250 ml der Lösung.
- Herstellung der 3-Amino-9-ethylcarbizol (AEC)-Substrat-Stammlösung
- Eine 20-mg-Tablette 3-Amino-9-ethylcarbazol (AEC) mit einer Glaspipette in 5 ml N,N, Dimethylformamid auflösen.
Vorsicht: AEC ist krebserregend.
- Aufbereitung der Protease-Stammlösung (z.B. Pronase) für die Antigengewinnung
- Lösen Sie 7 mg der Protease in 200 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) auf.
- Vorbereitung des Spülpuffers PBS-T
- Fügen Sie 10 ml Tween 80 bis 990 ml PBS hinzu. Mischen Sie es gut, um eine homogene Lösung zu bilden.
>4. Entparaffinisierung und Geweberehydrierung
Mit - einem Mikrotom wird ein 5 μm großer Paraffinschnitt hergestellt, auf einem Wasserbad bei 38 °C schwimmen gelassen und auf Objektträgern aufgefangen. Beschriften Sie die Objektträger mit einem reagenzienbeständigen Stift/Marker.
- Legen Sie die Objektträger auf ein Blech und schmelzen Sie sie 1 Stunde lang im 55-60 °C Ofen. Erhöhen Sie die Temperatur nicht über 60 °C, da dies das virale Antigen zerstören kann.
- Die Objektträger aus dem Ofen nehmen und sofort in 3 aufeinanderfolgenden Xylolspülungen von je 5 Minuten in den Gerichten 1, 2 und 3 entparaffinieren.
- Rehydrieren Sie die Abschnitte auf dem Objektträger durch sequentielles Eintauchen in abnehmende Verdünnung von Ethanol zu deionisiertem Wasser: (4 bis 11 ist eine Tauchspülung) Schale 4: Xylol/100 % Ethanol (1:1); Schale 5: 100 % Ethanol; Schale 6: 100 % Ethanol; Schale 7: 95 % Ethanol; Schale 8: 95 % Ethanol; Schale 9: 80 % Ethanol; Schale 10: 70 % Ethanol; Schale 11: deionisiertes Wasser (Abbildung 1. Aufbau der Schüssel).
Vorsicht: Xylol ist eine gefährliche Chemikalie und die Arbeit sollte in einem Abzug durchgeführt werden.
>5. Proteolytische Antigengewinnung
- Behandeln Sie die Objektträger 30 Minuten lang mit der Protease (2,5 μg/ml PBS) für die proteolytische Antigengewinnung in Schale 12.
- Anschließend 10 min in PBS-T spülen (Schale 13).
- 10 min lang mit 3% Wasserstoffperoxid behandeln (Gericht 14).
- Auch hier 10 min mit PBS-T waschen (Teller 15).
>6. Verfahren zum Färben
- Behandeln Sie die Objektträger nacheinander und halten Sie die restlichen Objektträger im Puffer (entfernen Sie nicht den gesamten Objektträgerhalter, sondern halten Sie die Objektträger nass). Entfernen Sie einen Objektträger und tupfen Sie überschüssigen Puffer (mit einem Papiertuch) von der Umgebung des Gewebeabschnitts ab, wobei Sie darauf achten sollten, den Gewebeabschnitt nicht zu stören. Inkubieren Sie die Objektträger in einer Feuchtigkeitskammer, indem Sie angefeuchtete Papiertücher auf die Labortischplatte bei Raumtemperatur mit normalem Ziegenserum (Blockierung) für 15 Minuten legen.
- Inkubieren Sie mit dem optimalen vorgegebenen Verdünnungsprimär-Tollwut-Antikörper (1:250 Verdünnung des Maus-Tollwut-Serums, unveröffentlicht) (Positivkontrolle) und Negativkontroll-Antikörpern bei Raumtemperatur wie oben (Schritt 6.1.) für 60 Minuten ohne Zwischenwäschen.
- Nach 60 min 10 min mit PBS-T waschen (Teller 16).
- Inkubieren Sie mit dem biotinylierten Antikörper (speziesspezifisch) in einer Feuchtigkeitskammer bei Raumtemperatur für 15 min (Handhabung wie in Schritt 6.1.).
- 10 min mit PBS-T waschen (Teller 16).
- Inkubieren Sie den Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase (HRP)-Komplex in einer Feuchtigkeitskammer bei Raumtemperatur für 15 min (Handhabung wie 6.1.).
- 10 min mit PBS-T waschen (Teller 16).
- Inkubieren Sie mit dem Peroxidasesubstrat Aminoethylcarbazol (AEC) in einer Feuchtigkeitskammer bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Stellen Sie AEC kurz vor der Verwendung her. Fügen Sie dazu 1 ml AEC-Stammlösung zu 14 ml 0,1 M Acetatpuffer mit einem pH-Wert von 5,2 hinzu. 0,15 ml 3%iges Peroxid, H2O2, zugeben. Filtrieren Sie das Gemisch kurz vor Gebrauch (0,45 μm Filter).
Anmerkung: Die Arbeitslösung von AEC ist nur 2-3 Stunden stabil. Die AEC-Stammlösung kann für längere Zeit im Kühlschrank gelagert werden.
- 10 min in entionisiertem Wasser waschen (Gericht 17)
- Gegengefärbt mit Gill's Hämatoxylin, verdünnt 1:2 mit deionisiertem Wasser für 2 min (Schale 18).
- Überschüssiges Hämatoxylin mit entionisiertem Wasser abspülen (Geschirr 19 und 20).
- In Scott's Leitungswasser 30 s (Bläulingslösung) Schale 21 spülen.
- 10 min in entionisiertem Wasser waschen (Teller 22)
- Entfernen Sie die Dias nacheinander - montieren Sie sie mit einem wasserlöslichen Einbettmedium.
- Lesen Sie Objektträger auf einem Lichtmikroskop.
