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Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
>1. Histopathologische Vorbereitung und Verarbeitung nach Erhalt einer Biopsie der Schläfenarterie
HINWEIS: Die Schläfenarterienbiopsie (TAB) wird unter örtlicher Betäubung und sterilen Bedingungen von einem zertifizierten Chirurgen durchgeführt. Nach der chirurgischen Entnahme eines 3 cm langen arteriellen Abschnitts auf der stärker betroffenen Seite wird die Probe sofort für 24 Stunden in Formalin fixiert, in 3 bis 4 mm große Abschnitte unterteilt und in Paraffin eingebettet, wobei sorgfältig auf die richtige Ausrichtung des Gewebes im Block geachtet wird, der dann bei Raumtemperatur gelagert wird. Die Probenauswahl erfolgt nach Überprüfung der Krankenakten. Die Diagnose basiert auf den Kriterien des American College of Rheumatology 1990, die verlangen, dass die Probanden 3 von 5 Bereichen erfüllen: Alter >50 Jahre, neue Kopfschmerzen, Druckempfindlichkeit der Schläfenarterie, eine Erythrozytensedimentationsrate >50 mm/Stunde nach der Westergren-Methode und eine abnormale TAB. Aus Sicherheitsgründen müssen beim Umgang mit Proben jederzeit Schutzhandschuhe getragen werden. Chemikalien und Antikörper.
- Aus den eingebetteten Blöcken mit einem Mikrotom 4-5 μm dicke Schnitte schneiden und mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) anfärben. Verwenden Sie zur Qualitätssicherung einen Kontrollabschnitt aus ausgewähltem Normalgewebe.
- Schneiden Sie die Schnitte auf ein warmes, auf 40 °C heißes Wasserbad, um Falten zu entfernen, und nehmen Sie sie mit einem mikroskopisch beschichteten Glasobjektträger auf. Legen Sie die Objektträger für 60 Minuten auf eine warme Platte in einen 60 °C heißen Ofen, um das Trocknen und das Anhaften des Objektträgers zu erleichtern.
- Legen Sie die Objektträger für 60 Minuten auf eine warme Platte in einen 60 °C heißen Ofen, um das Trocknen und das Anhaften des Objektträgers zu erleichtern.
- Montieren Sie 3 Schnitte auf Objektträger.
- Legen Sie die Dias in ein vertikales Gestell und trocknen Sie sie über Nacht bei 37 °C für 24 h.
- Legen Sie die Objektträger in ein Gefäß und lagern Sie sie bei 4 °C.
2. Immunhistochemische Aufbereitung, Entparaffinierung, Antigengewinnung und Färbung
- Laden Sie die Rutschen in ein Rutschenregal. Lassen Sie den Rost wie folgt durch die Schüsseln laufen: Zweimal in 100 % Xylol für 5 Minuten mit 10 Sekunden sanftem Rühren alle 30 Sekunden, einmal in 100 % Ethanol mit 10 Sekunden Rühren, einmal in 90 % Ethanol mit 10 Sekunden Rühren, einmal in 70 % Ethanol mit 10 Sekunden Rühren und zweimal in doppelt destilliertem H2O mit 10 Sekunden Rühren.
Anmerkung: Der Umgang mit Xylol und Aceton sollte in belüfteten Hauben erfolgen, um Inhalation und Atemwegstoxizität zu vermeiden.
- Entnehmen Sie das Antigen, indem Sie das Gestell in einen Glasbehälter mit 200 mL mit 10 mmol/l, pH 6,0 Citratpuffer umfüllen, der auf 95 °C vorgewärmt ist. Stellen Sie den Timer auf 30 Minuten im Wasserbad, kühlen Sie ihn dann 20 Minuten lang bei Raumtemperatur ab und spülen Sie ihn 5 Minuten lang mit fließendem Wasser ab.
- Entfernen Sie die endogene Peroxidaseaktivität, indem Sie 10 Minuten lang in 200 ml 3%igem Wasserstoffperoxid inkubieren. Waschen Sie die Objektträger 3 Mal in 200 μl Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBSS).
- Nehmen Sie die Objektträger aus dem Gestell und tupfen Sie sie vorsichtig ab, um überschüssigen Puffer zu entfernen. Für die Färbung fügen Sie 200 μl der folgenden Primärantikörper hinzu, fügen Sie Deckgläser auf Objektträger hinzu und inkubieren Sie sie 1 Stunde lang in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur:
Anti-Folatrezeptor-beta (FRB)-Antikörper, verdünnt 1:800
Monoklonales Maus-Anti-Human-CD68, 1:200 Verdünnung
Polyklonales Kaninchen Anti-CD3 1:100 Verdünnung
Anmerkung: Formalinfixierte, in Paraffin eingebettete Abschnitte der Plazenta wurden ebenfalls wie in den Schritten 2.1 bis 2.9 beschrieben bearbeitet und mit Anti-FRB18 inkubiert und als Positivkontrolle verwendet. Die Färbeergebnisse wurden durch Ermitteln der optimalen Antikörperkonzentration erzielt und durch Titration des Antikörpers in Doppelverdünnungen (z. B. 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600) erzielt.
- Entfernen Sie das Deckglas nach der Inkubation und entsorgen Sie es. Spülen Sie die Objektträger 3 Mal für jeweils 2 Minuten mit TBSS aus, lassen Sie den überschüssigen Puffer abtropfen und wischen Sie ihn ab.
- Fügen Sie 200 μl Sekundärantikörperlösung hinzu, die biotinylierten Anti-Kaninchen/Maus-Sekundärantikörper enthält, um mit dem nicht konjugierten Primärantikörper zu reagieren, der an das Gewebeantigen gebunden ist. Deckgläser auf Objektträger legen und in einer feuchten Kammer 45 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
- Entfernen Sie das Deckglas nach der Inkubation und entsorgen Sie es. Spülen Sie die Objektträger 3 Mal für jeweils 2 Minuten mit TBS aus, lassen Sie den überschüssigen Puffer abtropfen und wischen Sie ihn ab.
- Fügen Sie 200 μl Diaminobenzidin (DAB)+Substratpuffer (Imidazol-HCl)-Chromogen-System hinzu und inkubieren Sie 10 Minuten lang, um das Färbemuster zu visualisieren. Mit TBSS waschen und dann 10 Minuten lang unter fließendem Leitungswasser waschen.
- Mit Hämatoxylin 3 Minuten gegenfärben.
- Montieren Sie die Objektträger, indem Sie 70 μl Einbettmedium auf die Oberfläche des Objektträgers auftragen. Kippen Sie das Deckglas langsam auf das Eindeckmedium und vermeiden Sie Blasenbildung, wenn Sie es absenken. Warten Sie 24 Stunden, bis es getrocknet ist.
>3. Histopathologische und immunhistochemische (IHC) Analyse
Untersuchen Sie die H&E- und IHC-gefärbten Schnitte von GCA-positiven und normalen Probanden mit einem Lichtmikroskop.
- Für die H&E-gebeizten Abschnitte
- Beurteilen Sie die Gefäßarchitektur und identifizieren Sie Endothelzellen in der Tunica intima, glatte Muskelzellen in der Tunica media sowie Fibroblasten und Vasa vasorum in der Tunica adventitia.
- Identifizieren Sie GCA-Merkmale, zu denen Lymphozyten- und Makrophagen-/Histiozyteninfiltration, zelluläre Hyperplasie und Abbau der internen elastischen Lamina gehören.
- Analysieren Sie das lymphohistiozytäre Infiltrat, indem Sie die Anzahl der Makrophagen im Verhältnis zu den Lymphozyten identifizieren und quantifizieren. Beurteilen Sie das Ausmaß der Störung der inneren elastischen Lamina und der hyperplastischen Veränderungen in residenten Zellen und vergleichen Sie sie mit Kontrollen.
- Für die IHC-gebeizten Profile
- Untersuchen Sie das Färbemuster von FRB, beachten Sie seine Expression durch einen bestimmten Zelltyp oder bestimmte Zelltypen und seine Verteilung innerhalb der Gefäßschichten und seine Beziehung zum Gesamtimmuninfiltrat, dem Gesamtmakrophagenmarker, Anti-CD68, und dem Pan-Lymphozytenmarker, Anti-CD3.
- Quantifizieren Sie die Expression von FRB-, CD68- und CD3-Zellen, indem Sie die positiv gefärbten Zellen auf 10 mehrfach zufällig ausgewählten Hochleistungsfeldern (hpf) zählen und die Mittelwerte aufzeichnen.
Anmerkung: Die Identifizierung dieser normalen und pathologischen Zellen und Strukturen wurde von einem zertifizierten kardiovaskulären Pathologen und Rheumatologen durchgeführt, und die Ergebnisse wurden für alle Fälle aufgezeichnet.
- Erfassen Sie repräsentative Bilder mit einer Digitalkamera.
HINWEIS: Nach diesen Schritten können die verbleibenden Aliquots bei -80 °C gelagert werden.