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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem JoVE Veterinärprüfungsausschuss überprüft.
>1. Gewebeentnahme und UV-Vernetzung
- Euthanasieren Sie 2 erwachsene Mäuse mit Kohlendioxid (CO2) für 1-2 Minuten oder bis zum Stillstand der Atmung. Führen Sie als Nächstes eine Gebärmutterhalsluxation an jeder Maus durch.
- Ernten Sie für jedes Immunpräzipitationsexperiment etwa 100 mg Hoden von Mäusen angemessenen Alters (ein adulter Hoden in dieser Studie) und legen Sie das Gewebe in eiskalte, phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS).
- Entfernen Sie die Tunica albuginea vorsichtig mit einer Pinzette mit feiner Spitze.
- Geben Sie 3 mL eiskaltes PBS in einen Tissue-Wolf und zerkleinern Sie das Gewebe mit milder mechanischer Kraft mit einem losen Glasstößel (Typ A Glasstößel).
HINWEIS: Der Zweck dieses Schritts besteht nicht darin, Zellen zu lysieren, sondern das Gewebe auseinanderzuziehen. Die Erhaltung der Lebensfähigkeit und Integrität der Zellen ist wichtig.
- Übertragen Sie die Gewebesuspension in eine Zellkulturschale (10 cm Durchmesser) und fügen Sie eiskaltes PBS bis zu 6 mL hinzu.
- Schütteln Sie den Teller schnell, so dass die Flüssigkeit den Boden der Form gleichmäßig bedeckt. Wenn das Gewebe richtig geschliffen wird, sind gleichmäßig verteilte Samenkanälchen sichtbar, während das Vorhandensein von Gewebeklumpen darauf hinweist, dass die Gewebedispersion suboptimal ist.
- Die Suspension dreimal mit 400 mJ/cm2 bei 254 nm auf Eis vernetzen. Mischen Sie die Suspension zwischen jeder Bestrahlung.
Anmerkung: Für jedes neue Experiment sollte die Vernetzung optimiert werden.
- Die Suspension wird in einem konischen 15-ml-Röhrchen aufgefangen und das Pellet bei 1.200 x g für 5 min bei 4 °C hergestellt. Entfernen Sie den Überstand, resuspendieren Sie das Pellet in 1 mL PBS und geben Sie die Suspension dann in ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen. Bei 4 °C und 1.000 x g 2 min schleudern und den Überstand entfernen.
- Fahren Sie an dieser Stelle sofort mit dem Rest des Protokolls fort oder frieren Sie die Pellets in flüssigem Stickstoff ein und lagern Sie sie bis zur Verwendung bei -80 °C.
>2. Zubereitung der Perlen
- 125 μl magnetische Protein-A-Kügelchen pro Probe (Pellet) werden in ein frisches Zentrifugenröhrchen gegeben.
Anmerkung: Verwenden Sie Protein-G-Magnetkügelchen für Maus-Antikörper.
- Lege das Röhrchen auf den Magneten, um die Kügelchen von der Lösung zu trennen. Nach 10 s den Überstand entfernen. Waschen Sie die Kügelchen zweimal mit 1 mL eiskaltem Lysepuffer.
Anmerkung: In diesem Schritt folgt die anschließende Trennung der magnetischen Kügelchen des Proteins A. Die Zusammensetzung des Lysepuffers beträgt 50 mM Tris-HCl, pH 7,5; 100 mM NaCl; 1 % NP-40; 0,1 % Sicherheitsdatenblatt; 0,5 % Natriumdesoxycholat; 1/50 Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)-freier Proteasehemmer-Cocktail (frisch zugeben).
- Resuspendieren Sie die Beads in 100 μl Kaltlysepuffer mit 10 μg eCLIP-Antikörper. Röhren bei Raumtemperatur 45 min.
drehen
Anmerkung: Die endgültige Antikörperkonzentration für die Immunpräzipitation beträgt 10 μg/ml. Wenn die Antikörperkonzentration unbekannt ist, sollte die Antikörpermenge optimiert werden.
- Waschen Sie die Kügelchen zweimal mit 1 mL eiskaltem Lysepuffer.
>3. Gewebelyse und partielle RNA-Verdauung
- Resuspendieren Sie Gewebepellets in 1 ml Kaltlysepuffer (fügen Sie 22 μl 50x (EDTA)-freien Proteininhibitor-Cocktail und 11 μl RNase-Inhibitor zu 1 ml Lysepuffer hinzu).
- Resuspendierung von zwei UV-vernetzten Pellets und zwei unvernetzten Pellets pro Versuchsgruppe: UV-vernetzte-1-Pellets für die eCLIP-Bibliothek (UV-1); UV-vernetzte 2-Pellets für die eCLIP-Bibliothek (UV-2); nicht vernetzte 1-Pellets für die eCLIP-Bibliothek als Kontrolle (ohne UV); nicht-vernetzte 2-Pellets für IgG IP zum Nachweis der Spezifität von Antikörpern.
Anmerkung: Die ideale Kontrolle für die eCLIP-Bibliothek der UV-vernetzten Weittyp-Hoden ist die der UV-vernetzten Knockout-Hoden von Mäusen aus demselben Wurf.
- Lysieren Sie die Proben 15 Minuten lang auf Eis (um einen Abbau von Protein und RNA zu verhindern).
- Beschallung in einem digitalen Ultraschallgerät bei 10 % Amplitude für 5 min, bei 30 s an/30 s aus. Legen Sie die Probe immer auf Eis und reinigen Sie die Sonde zwischen den einzelnen Proben mit nukleasefreiem Wasser.
- Geben Sie 4 μl DNase in jedes Röhrchen und mischen Sie gut. 10 min bei 37 °C inkubieren, schütteln bei 1.200 U/min.
- 10 μl verdünnte RNase I (4 U/μl RNase I in PBS) zugeben und gut mischen. 5 min bei 37 °C inkubieren, schütteln bei 1.200 U/min.
- Das Lysat wird durch Zentrifugation bei 15.000 x g für 20 min (bei 4 °C) klar.
- Den Überstand vorsichtig einsammeln. Lassen Sie 50 μl Lysat übrig und entsorgen Sie das Pellet mit.
- Speichern Sie die Eingabeproben als RWB (Run for Western Blot) und RRI (Run for RNA Isolation). Speichern Sie 20 μl (2 %) von UV-1-, UV-2-, Nicht-UV- und IgG-Proben als Eingänge für die RWB-Gelbeladung. Sparen Sie 20 μl (2 %) UV-1- oder UV-2-Proben als Eingaben für die RRI-Gelbeladung.
>4. Immunpräzipitation
- 1 ml des Lysats (aus Schritt 3.7) werden zu den (in Abschnitt 2 hergestellten) Kügelchen gegeben und die Proben 2 h lang oder über Nacht bei 4 °C gedreht.
- Sammeln Sie die Perlen mit einem Magnetständer und entsorgen Sie den Überstand. Waschen Sie die Kügelchen zweimal mit 900 μl Puffer mit hohem Salzgehalt (50 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1 M NaCl; 1 mM EDTA; 1 % NP-40; 0,1 % SDS; 0,5 % Natriumdesoxycholat) und waschen Sie die Kügelchen dann zweimal mit 900 μl Waschpuffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,5; 10 mM MgCl2; 0,2 % Tween-20).
Anmerkung: Für die IgG-Probe pausieren Sie den Vorgang hier und lagern Sie sie auf Eis in einem Waschpuffer.