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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Vorbereitung von Materialien für die Injektion
- Eine 33-G-Nadel und eine 33-G-Spritze sterilisieren: zerlegen und bei 115 μCautoklavieren. Die Nadeln für die Injektion vorbereiten, indem sie in steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) aufgehen.
- Fluoreszenzmarkierte Partikel bei Raumtemperatur 5 - 10 min auftauen. Partikellösung für die Injektion vorbereiten, indem in sterilem PBS mit Calcium- und Magnesiumionen (Ca2+/Mg2+) eine 50 mg/ml-Lösung rekonstituiert wird.
Anmerkung: In diesem Protokoll werden AF488-markierte Partikel pilzlichen Ursprungs verwendet, die für Phagozytose-Assays validiert wurden. Für eine optimale Aufnahme die Partikel frisch und unmittelbar vor der Injektion vorbereiten.
ANMERKUNG 2: Die Partikelkonzentrationen können für jedes spezifische Experiment optimiert werden.
>2. Intravitreale Injektion von Bead-Lösung
HINWEIS: Zwei Personen müssen die Injektion durchführen, und zwar so, dass die Person, die die Injektion durchführt, die Maus halten und den Fokus auf dem Augapfel halten kann, während die andere Person die geladene Spritze weiterführt und den Kolben drückt.
- Betäuben Sie das Nagetier durch intraperitoneale Injektion von 100 mg/ml Ketamin und 10 mg/ml Xylazin in einer Dosis von 20 μl/10 g Körpergewicht. Verwenden Sie vor der Injektion eine Zehenkneifung, um den Grad der Anästhesie zu beurteilen.
Anmerkung: Isofluran hat einen tiefgreifenden Einfluss auf die Funktion myeloischer Zellen, daher sollte seine Verwendung in diesem Assay vermieden werden.
- Befüllen Sie die Nadel mit 0,5 μl fluoreszenzmarkierter Partikellösung.
- Legen Sie die Maus seitlich unter ein Operationsmikroskop (Abbildung 1A-B). Verwenden Sie ein weiches Material, z. B. eine Gelpackung, um die Maus besser zu positionieren. Bei jungen Mäusen, bei denen die Augen noch nicht geöffnet sind, öffnen Sie die Augenlider vorsichtig mit Hilfe einer feinen 45° abgewinkelten Pinzette, indem Sie entlang des Schlitzes einen Riss erzeugen, von dem aus sich die Augenlider schließlich öffnen.
- Mit Hilfe einer feinen 45° abgewinkelten Pinzette vorsichtig Druck um das Augenlid ausüben, so dass der Augapfel leicht aus der Augenhöhle herausspringt. Halten Sie den Kopf mit zwei Fingern knapp über dem Ohr und am Kiefer und dehnen Sie die Haut sanft parallel zu den Augenlidern, um das Auge leicht aus der Augenhöhle zu halten. Achten Sie darauf, nicht zu nah an den Hals zu greifen (Abbildung 1B).
- Um den Augapfel zu punktieren, führen Sie die Nadel der Spritze in den Hornhautlimbus ein (wo sich Hornhaut und Sklera verbinden). Dies ist bei pigmentierten Mäusen als grauer Kreis sichtbar. Ziehen Sie die Nadel leicht zurück, um ein kleines Volumen Glasflüssigkeit auszustoßen, und injizieren Sie dann. Die Person, die die Injektion durchführt, sollte die Maus mit einer Hand und die Nadel mit der anderen Hand vorsichtig halten. Die zweite Person sollte den Kolben langsam drücken.
- Ziehen Sie die Spritze langsam zurück. Tragen Sie feuchtigkeitsspendende Tropfen für die Augen auf, um das Auge mit Feuchtigkeit zu versorgen.
- Lassen Sie den Nager sich in einem Käfig über einem Wärmekissen erholen und überwachen Sie das Tier weiter. Wenn Sie mit Welpen arbeiten, setzen Sie das Tier nicht mit anderen aufmerksamen Tieren in einen Käfig zurück, bis es atmet und sich spontan bewegen kann. Wenn Sie mit erwachsenen Tieren arbeiten, setzen Sie das Nagetier nicht mit anderen aufmerksamen Tieren in einen Käfig zurück, bis es wieder auf dem Brustbein liegt.
>3. Entnahme von Netzhautgewebe
HINWEIS: Netzhautgewebe aus Augen, das nicht mit fluoreszenzmarkierten Partikeln injiziert wurde, sollte als Kontrolle für die durchflusszytometrische Analyse entnommen werden. Obwohl der Assay mit einer einzigen Netzhaut durchgeführt werden kann, sollten für eine optimale Leistung zwei Netzhäute zusammen gepoolt werden.
- Entnahme von Netzhautgewebe 3 Stunden nach intravitrealer Injektion von fluoreszierend markierten Partikeln.
Anmerkung: Während die Zeit nach der Injektion der Partikellösung für jedes spezifische Experiment optimiert werden kann, fanden wir heraus, dass 3 Stunden nach der Injektion die Partikelaufnahme in den meisten Schichten der Netzhaut zu sehen war (Abbildung 1C-D).
- Opfern Sie Mäuse durch Gebärmutterhalsluxation.
- Sammeln Sie die Augäpfel, indem Sie mit Hilfe einer feinen 45° abgewinkelten Pinzette sanft gegen das Augenlid drücken, um den Augapfel zu stützen. Positionieren Sie die Pinzette hinter dem Augapfel und ziehen Sie.
- Präparieren Sie die Netzhaut unter einem Präpariermikroskop. Übertragen Sie den Augapfel in eine Petrischale, die eine kleine Menge PBS mit Ca2+/Mg2+ enthält. Perforieren Sie den Augapfel im Hornhautlimbus an einer trockenen Stelle mit der Spitze einer superfeinen Pinzette.
- Halten Sie den Augapfel mit Hilfe einer feinen 45° abgewinkelten Pinzette fest und schneiden Sie mit einer Federschere um den Hornhautlimbus herum, bis etwa die Hälfte des Hornhautlimbusumfangs durchtrennt ist.
- Halten Sie den Augapfel mit der feinen 45o abgewinkelten Pinzette fest und bringen Sie den Augapfel in PBS. Mit einem zweiten Paar feiner 45o abgewinkelter Pinzetten reißen Sie Hornhaut und Sklera auseinander. Die Linse und die Netzhaut kommen intakt heraus.
- Trennen Sie die Linse und die Netzhaut. Entnehmen Sie die Netzhaut und übertragen Sie sie in ein 5,4-ml-Polystyrol-Reagenzglas mit 2 ml PBS mit Ca2+/Mg2+.
>4. Vorbereiten einer einzelligen Suspension
- Bereiten Sie einzellige Suspensionen mit einem Dissoziationskit für neuronales Gewebe mit geringfügigen Änderungen an den Anweisungen des Herstellers vor. Kurz gesagt, trituieren Sie die Netzhaut, indem Sie mit einer P1000-Pipette auf und ab pipettieren und einen enzymatischen Aufschluss bei 37 °C durchführen, ohne zu schütteln.
>5. Färben von Einzelzellsuspensionen für die durchflusszytometrische Analyse
- Die Zellen werden in 200 μl Färbepuffer (Dulbeccos phosphatgepufferte Kochsalzlösung mit 0,2 % Rinderserumalbumin (BSA) und 0,09 % Natriumazid) resuspendiert und auf eine 96-Well-Platte mit U-Boden übertragen. 5 min bei 130 x g.
zentrifugieren
Anmerkung: Natriumazid ist schädlich für Mensch und Umwelt. Verwenden Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung und entsorgen Sie Abfälle gemäß den örtlichen Vorschriften.
- Drehen Sie die Platte über ein Waschbecken, um den Überstand zu entsorgen. Um Fc-Rezeptoren zu blockieren, resuspendieren Sie die Zellen in 25 μl Färbepuffer, der 5 μg/ml Anti-Maus-CD16/CD32-Antikörper pro Vertiefung enthält. 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
- 25 μl Färbepuffer mit 0,5 μg/ml Anti-Maus-Ly6C-APC-Cy7, 0,5 μg/ml Anti-Maus-Ly6G-Pe-Cy7 und 2,5 μg/ml Anti-Maus-CD11b-BV650 zugeben. 15 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.
- 5 min bei 130 x g zentrifugieren. Die Platte umdrehen, um den Überstand zu entsorgen. Waschen durch Resuspendieren der Zellen in 200 μl Färbepuffer.
- 5 min bei 130 x g zentrifugieren. In 200 μl Fleckenpuffer mit 0,5 μg/ml Propidiumiodid (PI) resuspendieren. In 1,2-ml-Mikrotiterröhrchen umfüllen.
- Waschen Sie die Vertiefungen mit zusätzlichen 100 μl Färbepuffer mit 0,5 μg/ml PI und poolen Sie die vorherigen 200 μl in den 1,2-ml-Mikrotiterröhrchen. Es wird ein Gesamtvolumen von 300 μl gefärbter Zellen erhalten.
>6. Durchflusszytometrische Analyse
- Vermeiden Sie bei Verwendung eines herkömmlichen Drei-Laser-Lasers (violetter, blauer und roter Laser) PE-, PerCP-Cy5.5-, BV510- und PI-Farbstoffe, da die extrem hellen fluoreszierenden AF488-Partikel einen erheblichen Spillover verursachen. Verwenden Sie einen vierten (gelben) Laser, um diesen Assay zu optimieren, da er die Verwendung von PE-markierten Antikörpern und PI (im mCherry-Kanal anstelle des PerCP-Cy5.5-Kanals) ermöglicht (Abbildung 2).
Anmerkung: Wenn kein gelber Laser verfügbar ist, verwenden Sie einen Farbstoff zum Ausschluss toter Zellen in einem anderen Kanal.
- Gate auf PI-negative Zellen (PI-), um tote Zellen auszuschließen (Abbildung 2B).
- Nach Ausschluss toter Zellen schließt das Gate auf CD11b-positive Zellen (CD11b+) alle myeloischen Zellen ein (Abbildung 2C).
- Innerhalb der CD11b+-Population wird auf Ly6C-/Ly6G- gesetzt, um Neutrophile (CD11b+/Ly6G+) und Monozyten (CD11b+/Ly6C+; Abbildung 2D). Nach dem Gating auf Mikroglia (hier der Einfachheit halber als CD11b+/Ly6C-/Ly6G- definiert) sollten zwei klare Populationen sichtbar sein; ein negatives und ein positives für die fluoreszenzmarkierten Partikel. Phagozytäre Zellen haben Partikel aufgenommen und sind daher AF488+ (Abbildung 2E).
Anmerkung: Ly6C-positive oder Ly6G-positive Populationen können ebenfalls analysiert werden, um die Partikelaufnahme mit diesem Färbeansatz zu messen. Der Prozentsatz der phagozytären CD11b+-Zellen korreliert gut mit dem Prozentsatz der phagozytären Mikroglia (Abbildung 2F). Für Forscher ohne Erfahrung in der Durchflusszytometrie kann eine einfachere Analyse mit CD11b-Färbung allein durchgeführt werden, obwohl dies sowohl phagozytäre Neutrophile und Monozyten als auch Mikroglia umfasst. Innerhalb dieser CD11b+/Ly6C-/Ly6G-Population bestehen diese Zellen zu 99% > Mikroglia, wie durch Färbung mit den Markern F4/80 und CX3CR1 beurteilt wird; Diese Marker können hinzugefügt werden, sind aber in unseren Händen nicht notwendig.
