Ein Durchflusszytometrie-Assay zur Identifizierung von Immunzelluntergruppen in mononukleären Zellen des peripheren Blutes

Zusammenfassung

Quelle: Torchia, M. L. G., et al. Unterscheidung von sieben Immunzell-Untergruppen durch Zwei-Fluorochrom-Durchflusszytometrie. J. Vis. Exp. (2019)

Dieses Video demonstriert eine auf Durchflusszytometrie basierende Technik, bei der zwei Fluorochrome verwendet werden, um CD4⁺ und CD8⁺ T-Zellen, γδ T-Zellen, B-Zellen, natürliche Killerzellen (NK) und Monozyten in menschlichen mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) zu identifizieren. Nach der Inkubation der Zellen mit Fluorochrom-konjugierten Antikörpern gegen die Oberflächenmarker werden die Zelluntergruppen mit einer optimalen durchflusszytometrischen Gating-Strategie identifiziert.

Protokoll

Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.

HINWEIS: Dieses Protokoll wurde an frisch oder gefrorenen isolierten peripheren Blutzellen und Vollblut getestet.

>1. Zellfärbung

HINWEIS: Die Auswahl von Fluorochrompaaren mit praktisch keiner spektralen Überlappung ist wichtig, um die Streuung von Daten aufgrund des hohen Spillovers eines Fluorochroms im anderen Fluorochrom-Detektor zu reduzieren. Um eine optimale Identifizierung aller Zelluntergruppen zu erreichen, sollten Fluorochrome mit einer hohen Quantenausbeute wie die Antikörperpaare PE-BV421 und PE-APC verwendet werden.

1. Färbung von frischem und gefrorenem PBMC
   1. 100 μl PBMC (1 x 10⁶ Zellen) auf eine 96-Well-V-Bodenplatte übertragen.
      Anmerkung: Eine beliebige Anzahl von Zellen kleiner als 1 x 10⁶ kann mit ähnlichen Ergebnissen verwendet werden.
   2. Bei 350 x g für 3 min bei RT zentrifugieren und den Überstand vorsichtig ansaugen, ohne das Kügelchen zu stören. In jede Vertiefung werden 100 μl phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) gegeben, die einen lebend/tot fixierbaren Farbstoff enthält, der 10 Minuten lang mit freiem Amin auf Proteinen reagiert, um tote Zellen zu markieren.
   3. Bereiten Sie für jede Probe 30 μl einer Mischung vor, die alle Antikörper enthält (Anti-CD3, -CD56, TCRγδ in Fluorochrom A und Anti-CD4, CD8, CD19, CD14 in Fluorochrom B). Die Konzentrationen der Antikörper sind in Tabelle 1 und Tabelle 2 angegeben. In diesem Stadium können auch titrierte Antikörper gegen verschiedene Zielmoleküle und in verschiedenen Fluorochromen hinzugefügt werden (z.B. Tabelle 3).
      Anmerkung: Die Konzentration der Antikörper kann je nach Hersteller und Chargennummer variieren. Daher sollten Vorversuche durchgeführt werden, um das optimale Signal zu erreichen. PBS, PBS/0,5 % Rinderserumalbumin (BSA), PBS/0,2 % Natriumazid oder PBS/0,5 % BSA/0,1 % Natriumazid wurden mit ähnlichen Ergebnissen zur Verdünnung von Antikörpern verwendet. Zellen können auch in Volumina von anderen als 30 μl gefärbt werden, um diese Methode leicht in bereits bestehende Färbeprotokolle zu integrieren.
   4. Bei 350 x g für 3 min bei RT zentrifugieren und den Überstand vorsichtig ansaugen, ohne das Kügelchen zu stören. Geben Sie den Antikörpercocktail in jede Vertiefung und resuspendieren Sie ihn vorsichtig, ohne Blasen zu erzeugen. 30 min bei RT im Dunkeln inkubieren.
      Anmerkung: Es ist möglich, die Proben bei 4 °C mit ähnlichem Ergebnis zu färben.
   5. 150 μl Färbepuffer zugeben und bei 350 x g für 3 min bei RT zentrifugieren und den Überstand vorsichtig absaugen, ohne das Zellpellet zu stören. Resuspendieren Sie die Zellen in 200 μl PBS und erfassen Sie Daten auf einem Durchflusszytometer. Wenn das Färbevolumen geändert wird, achten Sie bitte auf eine mindestens 20-fache Verdünnung des ursprünglichen Antikörpermixes, der zum Waschen der überschüssigen Antikörper verwendet wurde.
      Anmerkung: Gefärbte Zellen können in PBS/2 % Paraformaldehyd fixiert, über Nacht im Kühlschrank bei 4 °C aufbewahrt und dann am nächsten Tag mit einem Durchflusszytometer entnommen werden.
      Vorsicht: Paraformaldehyd ist schädlich, wenn es verschluckt wird, und kann Hautreizungen verursachen

>2. Titration von Antikörpern

HINWEIS: Die Antikörpertitration ist der wichtigste Schritt, um qualitativ hochwertige, reproduzierbare Daten zu erhalten. Die Titration von anti-CD3, -CD8, -CD14, -CD19 und -TCR γδ folgt dem Standardverfahren, bei dem die Konzentration des Antikörpers zur optimalen Trennung von positiven und negativen Peaks durch den maximalen Färbeindex abgeleitet wird. Verdünnungen am Peak oder näher am Peak auf der steigenden Seite der Fleckenindexkurve sollten gewählt werden (Abbildung 1A-C). Der Anti-CD4-Antikörper wird titriert, um den Peak der CD4-positiven Population zwischen CD3-einfach positiven Populationen und CD3⁺/CD8⁺ T-Zellen zu platzieren, näher am CD3-einfach-positiven Signal, um die CD8dim-Populationen (CD8⁺ γδ T-Zellen und NK-T-Zellen) besser unterscheiden zu können. In diesem Sinne zielt die CD56-Titration darauf ab, NK CD56⁺-Zellen zwischen der CD3⁺- und der ^{CD3-Population} zu positionieren.

1. Maximale Fleckenindexkurve
   HINWEIS: Die Titration von anti-CD3, -CD8, -CD14, -CD19 und -TCR γδ erfolgt nach dem Standardverfahren, bei dem die Konzentration des Antikörpers zur optimalen Trennung von positiven und negativen Peaks durch eine Kurve des maximalen Färbeindex abgeleitet wird. Wenn dem Panel Antikörper gegen andere Marker zugesetzt werden, müssen diese ebenfalls mit einer maximalen Färbeindexkurve titriert werden.
   1. Bereiten Sie eine 2-fache Antikörperverdünnung vor, indem Sie 10 Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit 40 μl Färbepuffer füllen. Erhöhen Sie in der ersten Vertiefung das Endvolumen auf 80 μl Färbepuffer und fügen Sie den interessierenden Antikörper in einer Konzentration hinzu, die dem 4-fachen der vom Hersteller empfohlenen Konzentration entspricht.
   2. Gut mischen und 40 μl in die zweite Vertiefung geben. Gut mischen und diesen Schritt für alle anderen Vertiefungen wiederholen.
   3. Färben Sie 10 Proben PBMC oder Vollblut mit 30 μL der 10 verschiedenen 2-fachen Verdünnungen von Antikörpern nach dem zuvor beschriebenen Protokoll.
   4. Erfassen Sie Daten mit einem Durchflusszytometer und zeichnen Sie das Signal jeder Verdünnung auf (Abbildung 1A).
   5. Gate auf die negative und positive Population für jede Antikörperkonzentration. Eine Erhöhung der Konzentration von Antikörpern kann zu einem höheren Hintergrund führen. Ändern Sie daher die Größe des negativen Gatters entsprechend.
   6. Extrahieren Sie für jede Antikörperkonzentration Informationen über den Median und die Standardabweichung für die Fluoreszenzintensität der negativen Population und den Median für die Fluoreszenzintensität der positiven Population. Berechnen Sie für jede Antikörperkonzentration den Färbeindex mit folgender Formel: (mediane Fluoreszenzintensität der positiven Population — mediane Fluoreszenzintensität der negativen Population) ÷ (2 x Standardabweichung der Fluoreszenzintensität der negativen Population) (Abbildung 1B).
   7. Plotten Sie den Färbeindex im Vergleich zur Antikörperkonzentration, ausgedrückt als Bruchteil der Antikörperverdünnung (z. B. 1:10 Verdünnung = 0,1), und identifizieren Sie die Konzentration des Antikörpers mit dem maximalen Färbeindexwert (Abbildung 1C).
2. Anti-CD4- und -CD56-Antikörpertitration
   HINWEIS: Die Titration von Anti-CD4- und -CD56-Antikörpern beruht auf der vorherigen Titration der anderen Marker im Zwei-Fluorochrom-Panel. Für den Anti-CD4-Antikörper zielt die Titration darauf ab, das Anti-CD4-Signal zwischen dem doppelten CD8⁺/CD3⁺-Signal und der CD3-positiven Population zu platzieren (Abbildung 1D).
   1. Titrieren Sie die anti-CD4- und CD56-Antikörper mit einer 2-fachen Verdünnungsstrategie wie zuvor beschrieben, und fügen Sie dazwischen zusätzliche Konzentrationen hinzu, um den Konzentrationsbereich genau zu bestimmen, der es ermöglicht, CD4⁺ T-Zellen und NK-Zellen von den anderen Zellpopulationen zu trennen.
   2. Titrieren Sie den Anti-CD4-Antikörper, indem Sie das Anti-CD4-Signal zwischen dem doppelten CD8⁺/CD3⁺-Signal und der CD3-positiven Population platzieren (Abbildung 1D).
      Anmerkung: Besondere Sorgfalt sollte darauf verwendet werden, CD4⁺ T-Zellen klar von CD8⁺ schwachen Populationen zu trennen.
   3. Titrieren Sie den Anti-CD56-Antikörper nach einer ähnlichen Strategie wie die Anti-CD4-Antikörper-Titration, indem NK-Zellen zwischen der CD3-negativen und der CD3-positiven Population platziert werden.

>3. Gating-Strategie

1. Identifizieren Sie lymphozytäre und monozytäre Zellpopulationen und entfernen Sie abgestorbene Zellen und die meisten verbleibenden roten Blutkörperchen aus der Analyse.
   1. Wählen Sie die gesamte Population, die Lymphozyten und Monozyten enthält, basierend auf der Vorwärts- vs. Seitenstreufläche (FSC-A vs. SSC-A). Entfernen Sie Zellaggregate aus der Analyse über die Vorwärtsstreuungshöhe vs. Vorwärtsstreubreite (FSC-H vs. FSC-W) und die Seitenstreuhöhe vs. Seitenstreubreite (SSC-H vs. SSC-W).
   2. Verwenden Sie einen Unterscheidungsmarker für lebende/tote Blutkörperchen, um helle positive tote Blutkörperchen und verbleibende rote Blutkörperchen von der Analyse auszuschließen. Gate auf Lymphozyten und Monozyten basierend auf den verschiedenen FSC-A- und SSC-A-Profilen.
2. Zwei-Fluorochrom-Sieben-Marker-Gating-Strategie der lymphozytären Populationen.
   Anmerkung: Innerhalb der CD3-positiven Untergruppe können CD4⁺-, CD8⁺- und γδ-T-Zellen mit Antikörpern getrennt werden, die ausschließlich auf CD4, CD8 und den γδ-Rezeptor abzielen. Auf vergleichbare Weise können innerhalb der CD3-negativen Untergruppe B-Zellen, NK-Zellen und Monozyten mit Hilfe von Antikörpern gegen CD19, CD56 bzw. CD14 eindeutig identifiziert werden.
   1. Wählen Sie das Lymphozytengate aus und erstellen Sie ein Punktdiagramm mit einem von zwei Fluorochromen auf jeder Achse, die in diesem Protokoll verwendet werden (Abbildung 2B).
   2. Gate auf CD8⁺ T-Zellen, die als CD3⁺/CD8⁺ doppelt positive Zellen identifiziert wurden, in der oberen rechten Ecke des Dot-Plots (Abbildung 2B). Schließen Sie die schwache CD8-Population aus, die NKT-Zellen enthalten könnte. Gate auf CD4⁺ T-Zellen, die als Population zwischen CD8⁺ T-Zellen und den CD3-Einzel-positiven Populationen identifiziert wurden. Gate auf γδ T-Zellen, die als Zellen mit hohem CD3-Gehalt identifiziert wurden. Unterteilen Sie γδ T-Zellen in CD8-positive und CD8-negative.
   3. Gate auf NK-Zellen, identifiziert als die Population zwischen CD3-positiven und CD3-negativen Zellen. Unterteilen Sie NK-Zellen in CD8-positive und CD8-negative. Gate an B-Zellen, die als CD3-negative CD19⁺-Population identifiziert wurden, in der rechten unteren Ecke des Punktdiagramms.
   4. Wählen Sie die Monozytengatter aus und erstellen Sie ein Punktdiagramm mit einem von zwei Fluorochromen auf jeder Achse, die in diesem Protokoll verwendet werden (Abbildung 2C). Gate auf die CD3^-/CD14⁺ Population.

Tabelle 1: Antikörper-Panel für die Zwei-Fluorochrom-Immunzellfärbung von PBMC (BV421-PE-Kombination).

kg kg kg kg

Ziel	klonen	Fluorochrom	Verkäufer	Konzentration	Zweck
CD3	UCHT1	BV421	Bd	1/20	Abstammung
CD56	NCAM16.2	BV421	Bd	Nr. 1/900
TCRγδ	B1	BV421	bio	1/30
CD4	RPA-T4	Pe	Bd	Nr. 1/450
CD8	RPA-T8	Pe	Bd	1/20
CD14	M5E2	Pe	Bd	1/15
CD19	HIB19	Pe	Bd	Nr. 1/300
Abgestorbene Zellen		L/D Blau	Lt	Nr. 1/300	Unterscheidung zwischen Leben und Tod
BD = BD Biosciences, Bio = BioLegend, LT = Life Technologies

Tabelle 2: Antikörper-Panel für die Zwei-Fluorochrom-Immunzellfärbung von PBMC (APC-PE-Kombination).

kg kg kg kg kg

Ziel	klonen	Fluorochrom	Verkäufer	Konzentration	Zweck
CD3	UCHT1	Apc	Bd	1/20	Abstammung
CD56	NCAM16.2	Apc	Bd	1/60
TCRγδ	B1	Apc	bio	1/30
CD4	RPA-T4	Pe	Bd	Nr. 1/450
CD8	RPA-T8	Pe	Bd	1/20
CD14	M5E2	Pe	Bd	1/15
CD19	HIB19	Pe	Bd	Nr. 1/300
Abgestorbene Zellen		L/D Blau	Lt	Nr. 1/300	Unterscheidung zwischen Leben und Tod
BD = BD Biosciences, Bio = BioLegend, LT = Life Technologies

Tabelle 3: Antikörper-Panel zur Färbung von gefrorenem PBMC von einem Patienten mit multiplem Myelom.

kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg

Ziel	klonen	Fluorochrom	Katalog	Verkäufer	Konzentration	Zweck
CD3	UCHT1	BV421	562426	Bd	1/20	Abstammung
CD56	NCAM16.2	BV421	562751	Bd	Nr. 1/900
TCRγδ	B1	BV421	331217	bio	1/30
CD4	RPA-T4	Pe	555347	Bd	Nr. 1/450
CD8	RPA-T8	Pe	555367	Bd	1/20
CD14	M5E2	Pe	555398	Bd	1/15
CD19	HIB19	Pe	555413	Bd	Nr. 1/300
CCR7	Nr. G043H7	Nr. AF647	353217	bio	1/30	Differenzierung
CD45RA	HI100	APC-H7	560674	Bd	1/60
CCR4	1G1	PE-Cy7	561034	Bd	1/60	Die Teilmengen
CCR6	Nr. G034-E3	BV605	353419	bio	1/30
CXCR3	1C6/CXCR3	Nr. AF488	Artikel-Nr.: 561730	Bd	1/30
Nr. CD57	NK-1	PE-CF594	562488	Bd	Nr. 1/900	Aktivierung/Erschöpfung
HLA-DR	Nr. G46-6	BV510	563083	Bd	1/30
CD16	3G8	BUV395	563784	Bd	1/30	NK, Monozyten-Aktivierung
Tote Zellen		L/D Blau	Nr. L-23105	Lt	Nr. 1/300	Unterscheidung zwischen Leben und Tod

Ergebnisse

Abbildung 1: Repräsentative Antikörpertitration. (A) Das Dot Plot zeigt die CD8-Expression auf frischem PBMC, das mit der angegebenen Konzentration des Antikörpers gefärbt wurde. (B) Die Tabelle zeigt den Median und die Standardabweichung der Fluoreszenzintensität der CD8+-Population, die mediane Fluoreszenzintensität der CD8-Population und den abgeleiteten Färbei...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
CD3	BD Biowissenschaften	562426	Antikörper zur Färbung RRID: AB_11152082
CD56	BD Biowissenschaften	562751	Antikörper zur Färbung RRID: AB_2732054
TCRgd	BD Biowissenschaften	331217	Antikörper zur Färbung RRID: AB_2562316
CD4	BD Biowissenschaften	555347	Antikörper zur Färbung RRID: AB_395752
CD8	BD Biowissenschaften	555367	Antikörper zur Färbung RRID: AB_395770
CD14	BD Biowissenschaften	555398	Antikörper zur Färbung RRID: AB_395799
CD19	BD Biowissenschaften	555413	Antikörper zur Färbung RRID: AB_395813
CD3	BD Biowissenschaften	555335	Antikörper zur Färbung RRID: AB_398591
CD56	BD Biowissenschaften	555518	Antikörper zur Färbung RRID: AB_398601
TCRgd	BD Biowissenschaften	331211	Antikörper zur Färbung RRID: AB_1089215
CCR7	Biolegende	353217	Antikörper zur Färbung RRID: AB_10913812
CD45RA	BD Biowissenschaften	560674	Antikörper zur Färbung RRID: AB_1727497
CCR4	BD Biowissenschaften	561034	Antikörper zur Färbung RRID: AB_10563066
CCR6	BD Biowissenschaften	353419	Antikörper zur Färbung RRID: AB_11124539
CXCR3	BD Biowissenschaften	Artikel-Nr.: 561730	Antikörper zur Färbung RRID: AB_10894207
Nr. CD57	BD Biowissenschaften	562488	Antikörper zur Färbung RRID: AB_2737625
HLA-DR	BD Biowissenschaften	563083	Antikörper zur Färbung RRID: AB_2737994
CD16	BD Biowissenschaften	563784	Antikörper zur Färbung RRID: AB_2744293
Abgestorbene Zellen	Lebenstechnologien	Nr. L-23105	Unterscheidung zwischen Leben und Tod
96-Well-V-Bodenplatte	Thermo-Fischer	Artikel-Nr.: 249570	Platte zum Färben
FACSAria IIu Zellsortierer	BD Biowissenschaften		Durchflusszytometer
FCS Express 6	De Novo Software		FACS-Analyse
Graphpad Prisma	GraphPad-Software		Datenanalyse