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>1. Barcode von lysierten/fixierten Blutzellen
- Tauen Sie die lysierten/fixierten Zellproben aus der -80 °C-Lagerung langsam auf Eis auf, maximal 20 Proben können mit diesem System mit eindeutigen Barcodes gekennzeichnet und gepoolt werden. Verdünnen Sie den 10-fachen Barcoding-Perm-Puffer um 1:10 mit PBS; Stellen Sie genügend Puffer für ~3 mL pro Probe her.
- Füllen Sie eine unsterile Wanne mit dem CSM und eine mit dem 1X Barcoding Perm-Puffer. Geben Sie 1 mL eiskaltes CSM in frisch aufgetaute Proben, mischen Sie es gründlich mit einer Pipette und geben Sie es in die entsprechenden vormarkierten Polypropylen-Cluster-Röhrchen.
- Entnehmen Sie eine 10-μl-Probe, um Zellen mit einem automatisierten Zellzähler oder Hämozytometer zu zählen. Normalisieren Sie die Zellzahlen auf 1,5–2 x 106 Zellen pro Probe in jedem Cluster-Röhrchen: Entfernen und entsorgen Sie das Volumen der überschüssigen Zellen über 2 x 106 Zellen.
- Zentrifugieren Sie die Zellen bei 600 x g für 5 min bei Raumtemperatur. Resuspendieren Sie die Zellen in 1 mL 1X Barcoding Perm-Puffer mit einer Mehrkanalpipette und zentrifugieren Sie sie 5 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 600 x g. Saugen Sie den Überstand ab.
- Richten Sie die Cluster-Röhrchen in der gleichen Reihenfolge wie auf dem Barcode-Schlüssel angegeben auf einem Gestell aus, sodass die Probe mit dem Barcode übereinstimmt. Geben Sie 800 μl 1X Barcoding Perm-Puffer per Mehrkanalpipette zu allen Proben in den Cluster-Röhrchen, ohne das Zellpellet mit den Pipettenspitzen zu berühren (kein Mischen), um den Zellverlust zu reduzieren. Stellen Sie das Gestell mit den Cluster-Röhrchen beiseite.
- Entfernen Sie die Röhrenstreifen des 20-Plex Pd Barcoding Kit von -20 °C und tauen Sie sie bei Raumtemperatur auf. Geben Sie 100 μl 1X Barcoding Perm Puffer hinzu, mischen Sie gründlich und überführen Sie 120 μl der resuspendierten Barcode-Mischung in die entsprechenden Zellproben in den Cluster-Röhrchen.
- Gründlich mit einer Mehrkanalpipette mischen, damit es zu keiner Kreuzkontamination zwischen einzelnen Barcode-Proben kommt. Inkubieren Sie Cluster-Röhrchen 30 Minuten lang bei Raumtemperatur, damit die Barcodes die Zellen kennzeichnen können.
- Zentrifugieren Sie bei 600 x g für 5 min bei Raumtemperatur. Den Überstand aspirieren und dann in 1 ml CSM resuspendieren.
- Erneut zentrifugieren und in CSM resuspendieren.
Anmerkung: Jede Probe ist nun mit einem eindeutigen Barcode gekennzeichnet, und die Proben können gepoolt werden.
- Bei 600 x g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren und den Überstand absaugen. Übertragen Sie mit einer einzigen Pipette und mit derselben Spitze alle Zellpellets mit ~70–80 μl Restvolumen in ein Polystyrolröhrchen. Werfen Sie die Pipettenspitze NICHT aus; Legen Sie die einzelne Pipette mit dieser Spitze beiseite.
- Mit einer Mehrkanalpipette und neuen Spitzen können Sie ~100 μl CSM in jedes Original-Cluster-Röhrchen geben, um die Zellrückgewinnung zu maximieren. Übertragen Sie mit der einzelnen Pipette mit der beiseite gelegten Spitze alle Zellpellets mit ~100 μL Restvolumen in das gleiche Polystyrolröhrchen.
- Fügen Sie CSM hinzu, um das Styroporröhrchen (~3 mL) aufzufüllen. Zählen und notieren Sie die Zellennummer des gepoolten Barcode-Satzes. Bei 600 x g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren und den Überstand absaugen. Fahren Sie noch am selben Tag mit dem Färben der Proben mit Barcodes fort.
Hinweis: Es ist normal, dass beim Barcode-Prozess ein Zellverlust von ~20–30 % zu erwarten ist.
>2. Färbung von mit Barcodes angereicherten/fixierten Blutzellen und Vorbereitung für die Analyse auf einem Massenzytometrie-Instrument
Hinweis: Jeder 1X Titer des färbenden Antikörpers (1 μl Antikörper pro 100 μl Färbereaktion) kann normalerweise 3–4 x 106 Zellen färben. Wenn also alle barcodierten Proben in einem Röhrchen zusammengefasst werden, muss die Menge des Antikörpers hochskaliert werden. Wenn 20 barcodierte Proben 30 x 106 Zellen ergeben und jeder 1X-Titer 3–4 x 106 Zellen färben kann, benötigt die barcodierte Probe nur einen 10-fachen Titer, im Gegensatz zur Färbung jeder Probe einzeln, was eine 20-fache Menge an Antikörpern erfordern würde (1x pro einzelnem Röhrchen). Die Konzentration des Antikörpers im Verhältnis zur Zellzahl sollte für jeden einzelnen Antikörpercocktail sorgfältig titriert werden (hier nicht diskutiert).
- Färben Sie die Zellen mit Antikörpern (Table of Materials) für die Oberflächenfärbung und Zytokininduktion.
- Stellen Sie den Oberflächenfärbecocktail her, indem Sie die hinzuzufügende Menge berechnen und den Pipettierfehler berücksichtigen (d. h. wenn 20 Proben mit Barcodes von 2 x 106 Zellen in jeder Probe gefärbt werden, ist eine 10-fache Titerfärbung erforderlich; für die Berechnung des endgültigen Volumens kompensieren Sie den Pipettierfehler durch Herstellung einer 10,5-fachen endgültigen Färbelösung).
- Fügen Sie dem Zellenpellet mit Barcode das 10-fache des Oberflächenfärbevolumens hinzu. Um den Zellverlust zu reduzieren, mischen und messen Sie mit derselben Spitze das Volumen von Oberflächenflecken und Zellpellets.
- Basierend auf dem Volumen der Zellen und dem Färbecocktail fügen Sie CSM zu einem endgültigen Färbevolumen von 50 μl pro Anzahl der Zellproben hinzu (d. h. bei einem Satz von 20 Proben 50 μl x 20 = 1 ml). 30 Minuten bei 4 °C inkubieren. Die Probe alle 15 Minuten umrühren, um eine gleichmäßige Färbung zu fördern.
- Bereiten Sie während der Oberflächenfleckeninkubation den Perm/Wash-Puffer (Materialtabelle) vor, indem Sie ihn 1:10 mit filtriertem ddH2O verdünnen. Bereiten Sie Volumina von 2 mL für die Permeabilisierung und 5 mL für die Reinigung vor. Bei 4 °C oder auf Eis lagern.
- Das Oberflächenfärberöhrchen mit CSM auffüllen und bei 600 x g bei 4 °C 5 min zentrifugieren. Resuspendieren Sie die Probe mit Barcode in 2 mL mit 4 °C und 1:10 Verdünnungs-Perm/Wash-Puffer. Inkubieren Sie 20–30 Minuten lang bei 4 °C, um die Zellen vollständig zu permeabilisieren.
- Bei 600 x g bei 4 °C für 5 min zentrifugieren und den Überstand aspirieren.
- Befolgen Sie für die intrazelluläre Färbung ähnliche Schritte (wie für die Oberflächenfärbung). Verwenden Sie jedoch den 4 °C, 1:10 Verdünnungs-Perm/Wash-Puffer anstelle des CSM, um das Gesamtfärbevolumen so zu gestalten, dass die Zellen während der gesamten intrazellulären Färbung in einer permeabilisierenden Umgebung verbleiben.
- Geben Sie den intrazellulären Antikörpercocktail in das oberflächengefärbte und permeabilisierte Zellpellet (Schritte 2.1.2–2.1.7). Bringen Sie das Gesamtfärbevolumen auf 50 μl pro Anzahl von Zellproben. 60 Minuten bei 4 °C inkubieren. Die Probe alle 15 Minuten umrühren, um eine gleichmäßige Färbung zu gewährleisten.
- Bereiten Sie während der intrazellulären Färbung die Interkalatorlösung vor: 900 μl filtriertes PBS + 100 μl filtriertes 16 % PFA (Endkonzentration von 1,6 % PFA) + 0,2 μl 500 μM Interkalatorfarbstoff (Materialtabelle).
- Füllen Sie das Zellpellet + den intrazellulären Antikörpercocktail mit kaltem 1:10 Perm/Wash Puffer auf.
- Bei 600 x g bei 4 °C für 5 min zentrifugieren und den Überstand absaugen. Füllen Sie das Färberöhrchen mit CSM auf. Zählen und notieren Sie die Handynummer. Bei 600 x g bei 4 °C für 5 min zentrifugieren und den Überstand absaugen. Die Zellen werden in 1 ml Interkalatorlösung aus Schritt 4.9 resuspendiert. Inkubieren Sie mindestens 20 Minuten bei Raumtemperatur für eine vollständige Interkalation oder über Nacht bei 4 °C (Proben in Interkalatorlösung können bis zu 1 Woche bei 4 °C bleiben, bevor sie auf dem Massenzytometriegerät laufen gelassen werden).
- Bereiten Sie die Zellen für das Massenzytometrie-Instrument vor.
- Füllen Sie das Röhrchen mit 3 mL gefiltertem ddH2O auf und zentrifugieren Sie es bei 600 x g für 5 Minuten bei 4 °C. Resuspendieren Sie die Zellen in 3 mL gefiltertem ddH2O. Lassen Sie diese Suspension durch einen 100-μm-Filter, um Ablagerungen oder Aggregate zu entfernen, die das Massenzytometriegerät möglicherweise verstopfen könnten.
- Zählen und notieren Sie die Zellzahl nach der Filtration. Zentrifugieren bei 600 x g für 5 min bei 4 °C
- Bereiten Sie die Kalibrierkugellösung (Materialtabelle) vor, indem Sie sie 1:10 in filtriertem ddH2O verdünnen.
- Resuspendieren Sie die gefärbten Zellen in dem erforderlichen Volumen von 1:10 verdünnter Kalibrierkugellösung, um eine Zellkonzentration von ~1 x 106 Zellen/ml.
zu erreichen
Anmerkung: Für einen CyTOF1 bei 45 μL/min liegt das empfohlene Optimum bei 5 x 105 Zellen/ml; für Helios bei 30 μL/min, 7,5 x 105 Zellen/ml.
- Fahren Sie fort, die Probe auf dem Massenzytometriegerät laufen zu lassen.