Verwendung von DNA-basierten Zugsonden zur Bewertung der von Immunzellen ausgeübten Rezeptorkräfte

Zusammenfassung

Quelle: Ma, R. et al., DNA-Zugsonden zur Kartierung der transienten Piconewton-Rezeptorkräfte durch Immunzellen. J. vis. exp.(2021)

Das Video demonstriert eine Methode zur Bewertung von Rezeptorkräften, die von Immunzellen mit Polyethylenglykol-verankerten Goldnanopartikeln und DNA-Haarnadel-Zugsonden angewendet werden. CD8-positive T-Zell-Wechselwirkungen lösen die Entfaltung der Sonde aus und emittieren Fluoreszenz, während Verriegelungsstränge das Signal zur Quantifizierung der von Immunzellen ausgeübten Kräfte aufrechterhalten.

Protokoll

>1. Oligonukleotid-Zubereitung

1. Die Desoxyribonukleinsäure (DNA) des Ligandenstrangs wird in Wasser aufgelöst (18,2 MΩ spezifischer Widerstand, der im gesamten Protokoll verwendet wird). Wirbeln Sie die Lösung mit einer Tischzentrifuge auf und schleudern Sie sie herunter. Stimmen Sie das Wasservolumen so ein, dass die Endkonzentration 1 mM beträgt. Validieren Sie die Konzentration, indem Sie mit einem Nanotropfen-Spektralphotometer die Extinktion bei 260 nm messen und die Endkonzentration basierend auf dem Extinktionskoeffizienten des Oligonukleotids bestimmen.
   Anmerkung: Der Ligandenstrang weist an jedem Ende eine Modifikation auf, 5'-Amin und 3'-Biotin, um mit dem Fluorophor zu konjugieren und den biotinylierten Liganden darzustellen. Die Amingruppe im Ligandenstrang muss mit einem Fluorophor konjugiert werden. Für diese Konjugation wird aufgrund seiner hohen Helligkeit und Photostabilität der Cy3B-Farbstoff verwendet, der jedoch in der Regel nicht kommerziell angeboten wird und eine hauseigene Konjugation erfordert. Dementsprechend wird im folgenden Abschnitt die Konjugation zwischen Aminen und N-Hydroxysuccinimid (NHS)-ester-Farbstoffen beschrieben. Für Endanwender, die keinen Zugang zu Einrichtungen oder Ressourcen für die Nukleinsäuremodifikation haben, können modifizierte Nukleinsäuren stattdessen von Anbietern für kundenspezifische DNA-Synthese erworben werden, die helle und photostabile Farbstoffe anbieten, wie z. B. die Farbstofffamilien Alexa und Atto.
2. Bereiten Sie 10x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) und 1 M Natriumbicarbonat (NaHCO₃) Lösungen vor. Mischen Sie 10 μl der 1 mM Amin-Ligandenstranglösung (10 nmol) mit 10 μl 10x PBS, 10 μl 1 M NaHCO₃ und 60 μl H₂O. Lösen Sie unmittelbar vor Gebrauch 50 μg Cy3B N-Hydroxysuccinimid (NHS-Ester) in 10 μl Dimethylsulfoxid (DMSO) und fügen Sie der Mischung zu, um ein Gesamtreaktionsvolumen von 100 μl zu erhalten. Cy3B NHS-Ester zugeben letzte. Bei Raumtemperatur 1 h oder 4 °C über Nacht einwirken lassen.
3. Bereiten Sie den Atto647N-Verriegelungsstrang vor, indem Sie den Amin-Verriegelungsstrang mit dem Atto647N NHS-Ester konjugieren. Bereiten Sie 10x PBS und 1 M NaHCO₃ Lösung vor. Mischen Sie 10 μl der 1 mM Amin-Locking-Strang-Lösung (10 nmol) mit 10 μl 10x PBS, 10 μl 1 M NaHCO₃ und 60 μl H₂O. Lösen Sie unmittelbar vor Gebrauch 50 μg Atto647N NHS-Ester in 10 μl DMSO und fügen Sie der Mischung zu, um ein Gesamtreaktionsvolumen von 100 μl zu erhalten. Zuletzt wird Atto647N NHS-Ester zugegeben. Bei Raumtemperatur 1 h oder 4 °C über Nacht einwirken lassen.
4. Entfernen Sie nach den Reaktionen Nebenprodukte, überschüssigen Farbstoff und Salze durch P2-Entsalzungsgelfiltration. Verdünnen Sie das Reaktionsgemisch mit H₂O auf ein Gesamtvolumen von 300 μL, das für den anschließenden Reinigungsschritt der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) geeignet ist. Geben Sie 650 μl hydratisiertes P2-Gel in ein Zentrifugalgerät und schleudern Sie es 1 Minute lang bei 18.000 x g. Entfernen Sie die Flüssigkeit an der Unterseite des Geräts, geben Sie das Reaktionsgemisch in die Säule mit dem P2-Gel, drehen Sie es 1 Minute lang bei 18.000 x g herunter und sammeln Sie das Reaktionsgemisch am Boden des Geräts.
   Anmerkung: P2 Gel sollte mindestens 4 h vor der Verwendung mit H₂O hydratisiert werden.
5. Das entsalzte Reaktionsgemisch mit der HPLC unter Verwendung einer C18-Säule, die für die Oligonukleotidaufreinigung bestimmt ist, mit Lösungsmittel A: 0,1 M Triethylammoniumacetat (TEAA) in H₂O und B: Acetonitril (ACN) als mobile Phase für eine lineare Gradientenelution 10-100 % B über 50 min bei einer Flussrate von 0,5 mL/min. Injizieren Sie das entsalzte Reaktionsgemisch in die Umkehrphasen-HPLC mit einer 500-μl-Injektionsschleife zur Aufreinigung. Sammeln Sie das Produkt, das einen Absorptionspeak für die Desoxyribonukleinsäure, DNA (260 nm) und einen Absorptionspeak für das Fluorophor (560 nm für Cy3B und 647 nm für Atto647N) aufweist, und trocknen Sie sie über Nacht in einem Vakuumzentrifugalkonzentrator (siehe Abbildung 1A).
6. Rekonstituieren Sie das getrocknete Oligofarbstoff in 100 μl Wasser. Bestimmen Sie die Konzentration des Cy3B-Ligandenstrangs und des Atto647N-Locking-Strangs mit dem Nanotropfen-Spektralphotometer. Stellen Sie sicher, dass das Farbmarkierungsverhältnis nahe 1:1 liegt. Korrigieren Sie bei Bedarf die Absorption des Farbstoffs von 260 nm bei der Bestimmung der Oligonukleotidkonzentration.
7. Validieren Sie das gereinigte Produkt mit matrixgestützter Laserdesorptions-Ionisations-Flugzeit-Massenspektrometrie (MALDI-TOF-MS) unter Verwendung von 3-Hydroxypropionaldehyd (3-HPA) als Substrat in 50 % ACN/H₂O mit 0,1 % Trifluoressigsäure (TFA) und 5 mg/ml Ammoniumcitrat unter Verwendung von 0,5 μl des Produkts bei 1-5 μM für die MALDI-TOF-MS-Probenvorbereitung. Ein Beispiel für ein Massenspektrum ist in Abbildung 1B zu sehen.
8. Lösen Sie den Haarnadelstrang und den Quencherankerstrang in Wasser auf und stellen Sie sicher, dass die Konzentration der Stammlösungen zwischen 50 und 100 μM liegt.
   Anmerkung: Der Haarnadelstrang ist unverändert und kann direkt von einem Anbieter individuell synthetisiert werden. Der Ankerstrang weist eine Thiol-Verankerungsgruppe und einen Quencher BHQ2 auf und kann direkt von einem Anbieter kundenspezifisch synthetisiert werden.
9. Aliquotieren Sie alle Oligonukleotide. Für den kurzfristigen Gebrauch und die Lagerung sind diese Oligonukleotide bei 4 °C zu lagern. Für die Langzeitlagerung einfrieren und bei -20 °C aufbewahren. Zu diesem Zeitpunkt sind alle Oligonukleotide bereit für die Montage der DNA-Zugsonde.
   Anmerkung: Wiederholte Gefrier-Tau-Zyklen sind für Oligonukleotide unproblematisch.

>2. Vorbereitung der Oberfläche

HINWEIS: Die Vorbereitung der DNA-Haarnadel-Spannungssondensubstrate dauert zwei Tage. Die DNA-Haarnadel-Zugsonde wird auf Glasdeckgläser funktionalisiert.

1. Tag 1
   1. Legen Sie die 25-mm-Deckgläser auf ein Gestell aus Polytetrafluorethylen in ein 50-mL-Becherglas. Jedes Gestell kann bis zu 8 Deckgläser aufnehmen. Spülen Sie die Deckgläser aus, indem Sie sie dreimal in Wasser tauchen.
   2. Geben Sie 40 ml einer mit Wasser vermischten Ethanollösung im Verhältnis 1:1 (v:v) in das Becherglas mit dem Gestell und den Deckgläsern und verschließen Sie das Becherglas mit einer Paraffinfolie.
   3. Beschallen Sie das Becherglas 15 min lang in einem Ultraschallreiniger (Betriebsfrequenz 35 KHz), um die Deckgläser zu reinigen. Entsorgen Sie nach der Beschallung die Flüssigkeit und spülen Sie das Becherglas mit dem Gestell und den darin befindlichen Deckgläsern mindestens 6 Mal mit Wasser aus, um verbleibende organische Lösungsmittel zu entfernen.
   4. Bereiten Sie frische Piranha-Lösung vor, indem Sie Schwefelsäure und Wasserstoffperoxid im Verhältnis 3:1 mischen. Um 40 ml Piranha-Lösung herzustellen, geben Sie zuerst 30 ml Schwefelsäure in ein sauberes 50-ml-Becherglas und fügen Sie dann langsam 10 ml Wasserstoffperoxid, H₂O_{2, hinzu}. Die Piranha-Lösung erhitzt sich schnell und blubbert bei Zugabe von H₂O₂. Mischen Sie die Piranhas vorsichtig mit dem Ende einer Glaspipette.
   5. Übertragen Sie dann das Gestell, in dem sich die Deckgläser befinden, in das Becherglas mit der sanft gemischten Piranha-Lösung zum Ätzen (Abbildung 2A). Lassen Sie die Piranha-Lösung hydroxylieren und reinigen Sie die Deckgläser 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Übertragen Sie das Gestell nach dem Piranha-Ätzen mit einer Pinzette aus Stahl oder Polytetrafluorethylen in ein sauberes 50-ml-Becherglas mit Wasser und spülen Sie es erneut mindestens 6 Mal mit Wasser ab.
      Vorsicht: Große Mengen organischer Substanzen können heftig mit Piranha-Lösung reagieren und eine Explosion verursachen. Seien Sie vorsichtig und arbeiten Sie immer mit Piranha-Lösung in einem Abzug. Achten Sie darauf, einen Laborkittel, Handschuhe und eine Schutzbrille zu tragen. Bewahren Sie frische Piranha-Lösung niemals in einem verschlossenen Behälter auf.
      Anmerkung: Das Verhältnis von Wasserstoffperoxid zu Schwefelsäure sollte unter 1:2 (v:v) gehalten werden und sollte niemals 1:1 überschreiten. Wenn Sie das Gestell mit Deckgläsern in Piranha-Lösung tauchen, legen Sie diese langsam und vorsichtig in die Lösung. Entsorgen Sie die Lösung nicht sofort nach dem Ätzen, da sie noch aktiv und heiß ist. Lassen Sie es über Nacht im Becherglas, bevor Sie es in den Behälter für saure Abfälle gießen.
   6. Tauchen Sie das Gestell mit den Deckgläsern in ein 50-ml-Becherglas mit 40 mL Ethanol, um das Wasser zu entfernen. Entsorgen Sie das Ethanol und wiederholen Sie es 3 Mal, um sicherzustellen, dass das Wasser entfernt wurde.
   7. Tauchen Sie dann das Gestell in 3 % Aminopropyltriethoxysilan (APTES) (v/v) in 40 mL Ethanol, um 1 h lang bei Raumtemperatur mit dem -OH auf den Deckgläsern zu reagieren (Abbildung 2B).
      Anmerkung: Ethanol kann durch Aceton ersetzt werden.
   8. Spülen Sie die Oberflächen 6 Mal ab, indem Sie sie in 40 ml Ethanol tauchen, und trocknen Sie sie dann 20 Minuten lang bei 80 °C im Ofen. Lagern Sie die getrockneten aminmodifizierten Deckgläser nach dem Abkühlen bei -20 °C für die zukünftige Verwendung (bis zu 6 Monate).
   9. Decken Sie die untere Innenseite von Petrischalen aus Kunststoff mit einem Durchmesser von 10 cm mit Paraffinfolie ab. Die Paraffinfolie verhindert, dass die Deckgläser in die Petrischale rutschen und hilft, die Lösung für die nächsten Schritte der Funktionalisierung auf den Deckgläsern zu halten. Legen Sie die abgekühlten aminmodifizierten Deckgläser in die Petrischale. Die zu funktionalisierende Seite sollte nach oben zeigen.
   10. Um die Amingruppen auf den Deckgläsern zu modifizieren, geben Sie 300 μl 0,5 % w/v Liponsäure Poly(ethylenglykol) (PEG) NHS (LA-PEG-SC) und 2,5 % w/v mPEG NHS (mPEG-SC) in 0,1 M NaHCO₃ auf jedes Deckglas und inkubieren Sie 1 h bei Raumtemperatur (Abbildung 2C). Für jedes Deckglas von 25 mm sind 1,5 mg LA-PEG-SC und 7,5 mg mPEG-SC zu wiegen. Lösen Sie die NHS-Reagenzien unmittelbar auf, bevor Sie sie auf die Oberflächen geben, da sie in einer wässrigen Lösung bei Raumtemperatur eine kurze Halbwertszeit (~10 min) haben. Nach der Reaktion die Oberflächen 3 Mal mit Wasser abspülen.
       Anmerkung: Die NHS-Reaktion kann bei 4 °C über Nacht durchgeführt werden. NHS-Reagenzien haben eine längere Halbwertszeit vor der Hydrolyse bei 4 °C, die etwa 4-6 h beträgt. Dies führt zu einer dreitägigen Oberflächenvorbereitung.
   11. 100 μl 0,1 M Natriumbicarbonat, NaHCO₃ mit 1 mg/ml Sulfo-NHS-Acetat zu einem Satz "Sandwich"-Deckgläser (zwei einander gegenüberliegende Deckgläser mit Reaktionspuffer dazwischen) geben. Lassen Sie die Passivierung mindestens 30 Minuten lang einwirken. Um das Reagenz zu sparen, könnte dieser Schritt mit 50 μl 1 mg/ml Sulfo-NHS-Acetat durchgeführt werden. Nach der Passivierung dreimal mit Wasser nachspülen.
   12. Geben Sie 0,5 ml Goldnanopartikel (AuNP, 8,8 nm, Gerbsäure, 0,05 mg/ml) zu jedem Deckglas und inkubieren Sie es 30 Minuten lang bei Raumtemperatur (Abbildung 2D). Um das Reagenz zu sparen, kann dieser Schritt auch durch Sandwichen mit zwei Deckgläsern durchgeführt werden. Stellen Sie sicher, dass keine Salze aus den vorherigen Schritten im System vorhanden sind, um eine Aggregation von Goldnanopartikeln zu vermeiden. Lassen Sie die Deckgläser nach diesem Schritt nicht trocknen.
   13. In der Zwischenzeit werden 4,7 pN-Haarnadel, Cy3B-Ligandenstrang und BHQ2-Ankerstrang, die die DNA-Zugsonden bilden, in einem Verhältnis von 1,1:1:1 in 1 M Natriumchlorid (NaCl) bei 300 nM in einem Polymerase-Kettenreaktions-Röhrchen (PCR) vorhybridisiert. Glühen Sie die Stränge, indem Sie die Lösung 5 Minuten lang auf 95 °C erhitzen, und kühlen Sie dann allmählich ab, indem Sie die Temperatur über 30 Minuten in einem Thermocycler auf 20 °C senken.
   14. Spülen Sie die Deckgläser nach 30 Minuten Inkubation dreimal mit Wasser mit Goldnanopartikeln ab. Fügen Sie der geglühten DNA-Lösung einen zusätzlichen BHQ2-Ankerstrang (aus 100 μM Stamm) hinzu, um das Verhältnis zwischen dem BHQ2-Ankerstrang und dem Cy3B-Ligandenstrang auf 10:1 zu erhöhen. Zu diesem Zeitpunkt sollte die DNA-Lösung 300 nM Zugsondenkonstrukt und 2,7 μM BHQ2-Strang enthalten. Fügen Sie 100 μl pro zwei Deckgläser hinzu, um das "Sandwich" herzustellen (Abbildung 2E).
   15. Legen Sie vorsichtig eine nasse Labortaschentuchkugel in die Petrischale (weg von Deckgläsern) und verschließen Sie die Schale mit Paraffinfolie, um ein Austrocknen der Lösung zu verhindern. Die Form mit Folie abdecken und über Nacht bei 4 °C inkubieren.
2. Tag 2
   1. Waschen Sie die überschüssigen Sonden von den Deckgläsern mit 1x PBS ab. Überprüfen Sie die Oberflächenqualität der DNA-Zugsonde unter einem Epifluoreszenzmikroskop.
   2. Bereiten Sie 40 μg/ml Streptavidin in 1x PBS vor und inkubieren Sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur auf Deckgläsern (Abbildung 2F). In der Regel reichen 100 μL für ein 25 mm Deckglas aus. Nach der Inkubation 3 Mal mit PBS spülen, um die überschüssige Menge an Streptavidin wegzuspülen.
   3. Bereiten Sie 40 μg/ml biotinylierten Antikörper/Liganden in 1x PBS vor. 50-100 μl pro Sandwich zugeben und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren (Abbildung 2G). Nach der Inkubation dreimal mit PBS spülen, um die überschüssige Menge an biotinylierten Antikörpern/Liganden abzuwaschen.
   4. Montieren Sie die sauberen Bildgebungskammern mit Oberflächen sorgfältig. Oberflächen können beim Festziehen der Kammern leicht rissig werden. Geben Sie 0,5-1 ml Hank's balanced salt solution (HBSS) in die Bildgebungskammern und halten Sie sie für die Bildgebung mit Zellen bereit (Abbildung 2H).

>3. Bildgebung von Zellrezeptorkräften

1. Präparation von Immunzellen von Interesse an HBSS in einer Menge von 1-2 x 10⁶ Zellen/ml.
   Anmerkung: OT-1 CD8+ naive Zellen werden in dieser Arbeit als Beispiel verwendet. Reinigen Sie OT-1 CD8⁺ naive T-Zellen aus der Milz von getöteten Mäusen mit dem MACS Maus CD8⁺ T-Zell-Isolationskit mit einem MACS-Separator (Magnetic-Activated Cell Sorting) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Isolieren und reichern Sie die CD8⁺ T-Zellen an, indem Sie alle Nicht-CD8+ T-Zellen entfernen, an die der magnetisch abbauende Antikörpercocktail gebunden ist. Resuspendieren Sie gereinigte OT-1 CD8+ naive T-Zellen in HBSS bei 2 x 10⁶ Zellen/ml und bewahren Sie sie vor der Verwendung auf Eis auf.
2. Überprüfen Sie die Qualität der Oberfläche der DNA-Haarnadel-Zugsonde unter einem Fluoreszenzmikroskop (100-faches Objektiv) zur Qualitätskontrolle, bevor Sie Liganden hinzufügen oder Zellen plattieren. Abbildung und Quantifizierung der durchschnittlichen Hintergrundintensität im Cy3B-Kanal einer DNA-Haarnadel-Zugsondenoberfläche aus mindestens 5 verschiedenen Positionen und 3 Replikaten. Halten Sie die Aufnahmebedingungen konstant, so dass dieser Wert als zuverlässiger Marker für die Oberflächenqualität und die Sondendichte verwendet werden kann (Abbildung 3C).
   Anmerkung: Quantifizieren Sie die Anzahl der DNA-Stränge pro Gold-Nanopartikel und die Anzahl der Gold-Nanopartikel pro μm² bei den ersten Malen der Oberflächenvorbereitung gemäß der Literatur, was als weiterer zuverlässiger Marker für die Oberflächenqualität verwendet werden kann.
3. Platte ~4 x 10⁴ - 10 x 10⁴ Zellen auf jede DNA-Zugsonde funktionalisiertes Deckglas und lasse sie ~15 min bei Raumtemperatur anhaften und ausbreiten.
4. Wenn die Zellen auf die DNA-Haarnadel-Zugsonden plattiert werden und sich auszubreiten beginnen, bilden Sie die Fluoreszenzsignale, die im Cy3B-Kanal erzeugt werden, mit dem 100x-Objektiv ab (Abbildung 2I).
5. Nachdem die Zellen begonnen haben, ein Echtzeit-Spannungssignal auf der DNA-Haarnadel-Zugsondenoberfläche im Cy3B-Kanal zu erzeugen, nehmen Sie Bilder sowohl im Cy3B- als auch im Atto647N-Kanal auf (die Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRF) ergibt ein besseres Signal-Rausch-Verhältnis als die Epifluoreszenz). Anschließend wird der Atto647N-Strang in den Bildgebungskammern mit einer Endkonzentration von 200 nM für die mechanisch selektive Hybridisierung hinzugefügt.
6. Entfernen Sie nach 10 Minuten Inkubation schnell und vorsichtig den Puffer, der den fluoreszierenden Atto647N-Verriegelungsstrang enthält, und ersetzen Sie ihn durch frische ausgewogene Hank-Salze. Bilde erneut in den Kanälen Cy3B und Atto647N ab und bestimme den Korrelationskoeffizienten von Pearson mit der Fiji-Software.
7. Führen Sie zu dem Zeitpunkt, der für die Untersuchung von Interesse ist, einen nicht fluoreszierenden Verriegelungsstrang in die Zellen in der Bildgebungskammer ein, um das Spannungssignal zu speichern. Bereiten Sie das Verriegelungsstrangmaterial (100 μM) vor und geben Sie es in einer Endkonzentration von 1 μM zu den Zellen. Die Dauer der Verriegelung kann variieren, aber 10 Minuten ist die empfohlene Zeit.
8. Erfassen Sie Zeitrafferfilme oder Endpunktbilder in Epifluoreszenz sowohl für die qualitative Spannungskartierung als auch für die quantitative Analyse, je nach Bedarf (Abbildung 2J und Abbildung 4).
   Anmerkung: Wenn eine Zugmessung zu mehreren Zeitpunkten gewünscht wird, initiieren Sie das Löschen der gespeicherten Zugsignale durch Hinzufügen eines Entriegelungsstrangs. Um übermäßiges Spülen zu vermeiden, wird eine höhere Endkonzentration des Entriegelungsstrangs bei 2 μM verwendet, um eine Toehold-vermittelte Strangverdrängungsreaktion mit dem Lockstrang für 3 min zu initiieren, die die gespeicherten Signale löscht (Abbildung 2J). Spülen Sie die überschüssigen Oligonukleotide vorsichtig mit HBSS ab. Die Oberfläche der DNA-Haarnadel-Zugsonde und die Zellen sind bereit für eine weitere Runde der Spannungsspeicherung und -kartierung. Das Entsperren von Spannungssignalen ist nicht erforderlich, wenn nur ein Zeitpunkt für die Studie von Interesse ist.

Ergebnisse

Abbildung 1: Beispiele für die Herstellung von Oligonukleotiden.(A) HPLC-Chromatogramm der Reinigung von Cy3B-Ligandenstrangen; (B) MALDI-TOF-MS-Spektren des Produkts; (C) Tabelle der berechneten Masse und der gefundenen m/z-Peaks des Ausgangsmaterials und des markierten Oligonukleotids.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
3-Hydroxypicolinsäure (3-HPA)	Sigma	Artikel-Nr.: 56197	Maldi-TOF-MS-Matrix
mPEG-SC	Biochempeg	MF001023-2K	Vorbereitung der Oberfläche
(3-Aminopropyl)triethoxysilan	Acros	AC430941000	Vorbereitung der Oberfläche
10x Puffer zur Lyse roter Blutkörperchen	Biolegende	Tel.: 00-4333-57	Puffer
8,8 nm Gold-Nanopartikel, Gerbsäure	Nanocomposix	Sonderanfertigung	Vorbereitung der Oberfläche
Atto647N NHS-Ester	Sigma	18373-1MG-F	Fluorophor, Oligo-Vorbereitung
Attofluor Cell Chamber, für die Mikroskopie	Thermo Fisher Scientific	Nr. A7816	Bildgebung
BD Spritzen nur mit Luer-Lok	BD Biowissenschaften	309657	Zellen
Biotinyliertes Anti-Maus-CD3e	Ebiowissenschaften	Artikel-Nr.: 13-0031-82	Antikörper/Ligand
Biotinyliertes pMHC-Ovalbumin (SIINFEKL)	NIH Tetramer Core Facility an der Emory University	Na	Antikörper/Ligand
Rinderserumalbumin	Sigma	735078001	Blockieren Sie unspezifische Interaktionen
Zellsiebe	Biologix	Tel.: 15-1100	Zellen
Deckglas Mini-Rack, teflon	Thermo Fisher Scientific	Nr. C14784	Vorbereitung der Oberfläche
Cy3B NHS-Ester	GE Gesundheitswesen	PA63101	Fluorophor, Oligo-Vorbereitung
Dulbeccos phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS)	Corning	21-031-CM	Puffer
Ethanol	Sigma	459836	Vorbereitung der Oberfläche
Hanks ausgewogene Salze (HBSS)	Sigma	Nr. H8264	Puffer
Wasserstoffperoxid	Sigma	Nr. H1009	Vorbereitung der Oberfläche
LA-PEG-SC	Biochempeg	HE039023-3,4 K	Vorbereitung der Oberfläche
Midi MACS (LS) Startup-Kit	Miltenyi Biotec	Tel.: 130-042-301	Zellen
CD8+ T-Zell-Isolationskit für Mäuse	Miltenyi Biotec	Tel.: 130-104-075	Zellen
Nanosep MF Zentrifugalgeräte	Pall Labor	ODM02C35	Oligo-Vorbereitung
Nr. 2 runde Glasdeckgläser	VWR	Artikel-Nr.: 48382-085	Vorbereitung der Oberfläche
NTA-SAM	Dojindo Molecular Technologies	Nr. N475-10	Vorbereitung der Oberfläche
P2 Gel	Bio-rad	1504118	Oligo-Vorbereitung
Schwefelsäure	EMD Millipore Gesellschaft	SX1244-6	Vorbereitung der Oberfläche
Sulfo-NHS-Acetat	Thermo Fisher Scientific	Artikel-Nr.: 26777	Vorbereitung der Oberfläche
Ausrüstung
Agilent AdvanceBio Oligonukleotid C18 Säule, 4,6 x 150 mm, 2,7 μm	Artikel-Nr.: 653950-702		Oligonukleotid-Zubereitung
Barnstead Nanoreines Wasseraufbereitungssystem	Thermo Fischer		Wasser
CFI Apo 100× NA 1.49 Objektiv	Nikon		Mikroskopie
Cy5 Würfel	chroma		Mikroskopie
Evolve Elektronenmultiplizierendes ladungsgekoppeltes Bauelement (EMCCD)	Photometrie		Mikroskopie
Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie	Agilent 1100		Oligonukleotid-Zubereitung
Intensivlicht-Epifluoreszenzquelle	Nikon		Mikroskopie
Matrixgestütztes Laser-Desorptions-/Ionisations-Flugzeit-Massenspektrometer (MALDI-TOF-MS)	Voyager STR		Oligonukleotid-Zubereitung
Nanodrop 2000 UV-Vis-Spektralphotometer	Thermo Fischer		Oligonukleotid-Zubereitung
Nikon Eclipse Ti inverses Mikroskop	Nikon		Mikroskopie
Nikon Perfektes Fokussystem	Nikon		Mikroskopie
NIS Elements Software	Nikon		Mikroskopie
Quad-Band TIRF 405/488/561/647 Würfel	chroma		Mikroskopie
RICM Würfel	chroma		Mikroskopie
TIRF-Launcher mit 488 nm (50 mW), 561 nm (50 mW) und 640 nm	kohärent		Mikroskopie
TRITC Würfel	chroma		Mikroskopie
Name des Oligos	5' Modifikation / 3' Modifikation	Sequenz (5' bis 3')	gebrauchen
15mer Amin Verriegelungsstrang	5' Modifikation: keine Änderung 3' Modifikation: /3AmMO/	AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA	Sperren des Echtzeit-Zugsignals
15mer Atto647N Sicherungslitze	5' Modifikation: Atto647N 3' Modifikation: /3AmMO/	AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA	Sperren des Echtzeit-Zugsignals
15mer nicht-fluoreszenter Locking-Strang	5' Modifikation: keine Änderung 3'-Modifikation: keine Modifikation	A AAA AAC ATT TAT AC	Sperren des Echtzeit-Zugsignals für die quantitative Analyse
4,7 pN Haarnadel-Strang	5' Modifikation: keine Änderung 3'-Modifikation: keine Modifikation	GTGAAATACCGCAGATGCGT TTGTATAAATGTTTTTTTCATTTAT ACTTTAAGAGCGCCACGTAGCC CAGC	Haarnadel-Sonde
Amin-Liganden-Strang	5' Modifikation: /5AmMC6/ 3' Änderung: /3Bio/	CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT	Haarnadel-Sonde
BHQ2 Ankerstrang	5' Modifikation: /5ThiolMC6-D/ 3' Änderung: /3BHQ_2/	TTTGCTGGGCTACGTGGCGCTCTT	Haarnadel-Sonde
Cy3B-Ligandenstrang	5' Modifikation: Cy3B 3' Änderung: /3Bio/	CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT	Haarnadel-Sonde
Strang entriegeln	5' Modifikation: keine Änderung 3'-Modifikation: keine Modifikation	TAG GTA GGG TAT AAA TGT TTT TTT C	Entsperren des akkumulierten Spannungssignals