Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Vorbereitung der CFSE-Bestände und Lagerung
- Bereiten Sie einen 5-mM-Stamm mit 5- und 6-Carboxyfluorescein-Diacetat-Succinimidylester (CFSE) in Dimethylsulfoxid vor. Wirbel. Geben Sie 100 μl Aliquots in sterile Mikroröhrchen mit Schraubverschluss von 0,5 ml. Aliquots bei -80 °C lagern.
>2. Mäuse
- Verwenden Sie männliche oder weibliche Inzuchtmäuse im Alter von 8 bis 12 Wochen. Geschlecht und Alter entsprechende Tiere werden bevorzugt. Stellen Sie sicher, dass die erforderlichen tierethischen Genehmigungen vorliegen, bevor Sie mit Versuchen beginnen.
>3. Immobilisierung von Tieren mit Isofluran-Gasanästhesie
- Belasten Sie das Anästhesiegerät mit Isofluran. Füllen Sie die 10 ml gasdichte Glasspritze mit Isofluran. Vermeiden Sie das Einbringen von Luftblasen. Verbinden Sie die Spritze und den Flüssigkeitseinlass mit dem mitgelieferten Schlauch und bewegen Sie den Schieber nach vorne, bis die Flüssigkeit im Verbindungsschlauch sichtbar kurz davor ist, in den Vaporizer einzutreten.
Anmerkung: Bewahren Sie Isofluran nicht in der Spritze auf, wenn Sie es nicht verwenden.
- Tiere werden in der Induktionskammer mit Isofluran betäubt, wobei der Luftstrom bei ca. 400 - 500 ml/min und die Isoflurankonzentration bei 3,5 % gehalten wird.
Anmerkung: Das Gerät funktioniert nicht ohne Luftstrom.
- Sobald die Tiere schlafen, drehen Sie den Absperrhahn an der Anästhesieeinheit, um das Isoflurangas zum Maskenstück zu leiten. Vergewissern Sie sich, dass das Maskenteil intakt ist, um ein Austreten von Gas zu vermeiden. Der Luftstrom kann bei 400 ml/min gehalten werden, alternativ kann er auf 200 ml/min verringert werden. Reduzieren Sie die Isoflurankonzentration auf 2,6 %.
Anmerkung: Die anästhetische Wirkung kann durch Anpassung der Flussrate erhöht und/oder verringert werden.
>4. BCG-Injektionen und Rückgewinnung
- Visuelle Bestätigung und Durchführung von Tests, wie z. B. dem Zehenquetschreflextest, um sicherzustellen, dass Mäuse auf dem Isofluran-Maskenstück immobilisiert/schlafend sind, bevor Injektionen durchgeführt werden.
- 1 x 106 koloniebildende Einheiten Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guérin (BCG) in 30 μl phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit einer Spritze, die mit einer 29 G x 1/2 Zoll Nadel versehen ist, impfen
Anmerkung: Die Erzeugung von Mykobakterienstämmen wird in der ursprünglichen Beschreibung dieses Verfahrens kurz beschrieben und an anderer Stelle ausführlich beschrieben. BCG ist auch aus kommerziellen Quellen erhältlich. Die Autoren empfehlen, BCG mit Pulsschall zu beschallen oder durch eine Spritze zu leiten, um die Klumpen vor der Inokulation in Mäuse aufzulösen. BCG wird hier als mikrobieller Stimulus wiederholt, da es in der ursprünglichen Beschreibung dieses Protokolls verwendet wurde 3, aber die Autoren ermutigen sicherlich dazu, andere mikrobielle Stimuli zu testen.
- Führen Sie das gleiche Verfahren wie oben beschrieben für die Injektion von PBS in Kontrollmäuse durch.
- Überwachen Sie die Tiere nach der Injektion, um zu bestätigen, dass die Genesung nach der Narkose erfolgreich ist und dass sich die Tiere auf dem injizierten Hinterfußballen abstützen können.
>5. CFSE-Injektionen
- Vorbereitung von CFSE für Injektionen
- Ein Fläschchen mit 5 mM CFSE-Stammlösung bei -80 °C auftauen. CFSE 10-fach in PBS verdünnen. Resuspendieren Sie die Lösung gründlich, bevor Sie die Spritze zur Vorbereitung der Injektion befüllen.
- CFSE-Injektion und -Genesung
- Wiederholen Sie das Verfahren zur Betäubung von Tieren in Abschnitt 3. Injizieren Sie 20 μl 0,5 mM CFSE in das hintere Fußpolster, das zuvor BCG oder PBS erhalten hat.
Anmerkung: Die Injektion von CFSE sollte am Tag vor (24 Stunden) dem geplanten Opfertermin durchgeführt werden.
>6. Chirurgische Entfernung des Kniekehle-Lymphknotens (pLN)
HINWEIS: Die Verwendung von sterilisierten chirurgischen Instrumenten und deren wiederholte Dekontamination in 70% Ethanol werden in diesem Schritt empfohlen.
- Euthanasiere die Mäuse. Besprühen Sie das Tier mit 70% Ethanol. Stecken Sie das Tier in Rückenlage auf ein Sezierbrett.
Anmerkung: Die Autoren können eine Euthanasie durch Zervixluxation empfehlen.
- Machen Sie vorsichtig einen vertikalen Schnitt im hinteren Oberschenkel. Reinigen Sie Muskeln und Fett mit einer Schere und Pinzette, um das pLN, das sich tief im Fettbeutel in der Kniekehle befindet, freizulegen und folglich zu entfernen.
- Übertragen Sie das pLN auf 0,5 ml steriles PBS auf Eis.
>7. Erzeugung von einzelliger Suspension aus pLN
- Homogenisieren Sie das pLN durch ein 70-Mikron-Zellsieb, das in einer 6-Well-Platte mit 5 ml PBS oder Fluoreszenz-aktiviertem Zellsortierpuffer (FACS) platziert wird (PBS enthält 2 % fötales Kälberserum (FCS), 5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und 1 mM Natriumazid). Mit dem hinteren Ende einer 3-ml-Spritze durch das Sieb homogenisieren.
Anmerkung: Natriumazid ist giftig und sollte mit Vorsicht gehandhabt werden.
- Waschen Sie das Sieb mit weiteren 5 ml PBS- oder FACS-Puffer, sammeln Sie das Material in einem 15-ml-Röhrchen und pelletieren Sie die Zellen bei 277 x g (1.200 U/min, R = 172 mm) für 5 min, 4 °C. Alternativ können pLNs direkt in Mikrozentrifugenröhrchen mit Polypropylen-Homogenisatoren homogenisiert werden.
- Basierend auf der Pelletgröße resuspendieren Sie die pLN-Suspension in einem geeigneten Volumen PBS- oder FACS-Puffer, z. B. 200 - 1.000 μl. Verwenden Sie eine Zählkammer, um die Gesamtzellzahl zu quantifizieren, die aus jeder LN-Suspension erhalten wird. Verwenden Sie Trypanblau, um tote/sterbende Zellen auszuschließen.
>8. Zellfärbung und Durchflusszytometrie
- 1 - 10 x 106 Zellen in 5 ml Polystyrolröhrchen mit rundem Boden umfüllen. Mit FACS-Puffer waschen und durch Zentrifugation bei 277 x g (1.200 U/min, R= 172 mm) für 5 min, 4 °C pelletieren.
- Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 50 - 100 μl Antikörpercocktail (siehe Dendritische Zellmarker [DC] für die Oberflächenfärbung, Materialtabelle) mit 0,5 - 1 μg Anti-Maus-CD16/CD32 (um unspezifische Fc-vermittelte Wechselwirkungen zu blockieren) in FACS-Puffer für 30 - 45 Minuten auf Eis. Schützen Sie die Proben vor Licht.
- Nach der Inkubation werden die Zellen mit FACS-Puffer und Pellet durch Zentrifugation bei 277 x g (1.200 U/min, R = 172 mm) für 5 min, 4 °C gewaschen
.
- Resuspendieren Sie die Zellen in 50 - 100 μl FACS-Puffer. Erfassen Sie Daten auf einem Durchflusszytometer.
