Alle Eingriffe mit menschlichen Teilnehmern wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für das Wohlergehen des Menschen durchgeführt und vom lokalen institutionellen Prüfungsausschuss überprüft.
>1. A. fumigatus Kultur und Bedingungen
- Bereiten Sie Glucose Minimum Agar Medium wie beschrieben vor.
- Das Medium mit 1 M Natriumhydroxid (NaOH) auf pH 6,5 einstellen und 20 min lang bei 120 °C autoklavieren.
- Auf 65 °C abkühlen lassen.
- Gießen Sie in einer sterilen Strömungshaube 30 ml gekühltes Medium in einen T75-Kolben und lassen Sie ihn abkühlen, wobei der Flaschenhals auf einer 25-ml-Pipette aufliegt, um eine Agar-Schräge zu erzeugen.
- Den dsRed Af293-Aspergillus fumigatus-Stamm auf dem Agar ausstreichen und 7 Tage lang bei 37 °C + 5 % Kohlendioxid (CO2) inkubieren. Zwei Kolben ergeben etwa 109 Konidien in 5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) vor der Biotinylierung.
>2. A. fumigatus Markierung und Zubereitung
HINWEIS: Wenn Sie diesen Test zum ersten Mal durchführen, bereiten Sie den Elternstamm Af293-A. fumigatus vor. Entnehmen Sie Proben beider Stämme in Mikrozentrifugenröhrchen und markieren Sie nur einen von jedem Stamm wie unten beschrieben. Auf diese Weise können Konidien ohne Farbe und Konidien mit einer einzigen Farbe, entweder dsRed oder Alexa Fluor 633 (AF633), gesteuert werden, um den Aufbau und die Ausrüstung zu testen.
- Ernten Sie A. fumigatus conidia, indem Sie die Kultur mit 30 mL PBS + 0,05 % Tween-80 eintauchen. Die resultierende Suspension wird durch ein 40-μm-Zellsieb in ein 50-ml-Röhrchen filtriert, um Hyphenfragmente zu entfernen.
- Zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei 805 x g, entfernen Sie den Überstand und waschen Sie es einmal in 20 ml sterilem PBS. Poolkonidien aus zwei Platten des gleichen Stammes während des Waschschritts.
- Nach dem Waschschritt resuspendieren Sie das Pellet in 5 mL PBS und überführen Sie 1 mL Aliquots der konidialen Suspension in Mikrozentrifugenröhrchen. 1 mL Suspension jedes Stammes ist in der Regel ausreichend für die Bildgebung lebender Zellen. Die restlichen Aliquots in Folie wickeln und bei 4 °C lagern.
- Aliquots der Konidiensuspension bei 9.300 x g für 10 min bei Raumtemperatur zentrifugieren und den Überstand vorsichtig entfernen. Resuspendieren Sie das Konidienpellet in 1 mL 0,05 M Natriumbicarbonat (NaHCO3) pH 8,3.
- 10 mg Biotin/200 μl Dimethylsulfoxid (DMSO)-Stammlösung durch Rekonstitution von 25 mg Biotin in 500 μl DMSO herstellen. Geben Sie 10 μl Biotin/DMSO-Stammlösung in das Mikrozentrifugenröhrchen, decken Sie es mit Aluminiumfolie ab und inkubieren Sie es 2 h lang auf einer Wippe bei 4 °C.
- Der Rest der Biotin/DMSO-Stammlösung aliquotiert und zur Verwendung in nachfolgenden Versuchen bei -20 °C einfrieren.
- 10 min bei 9.300 x g zentrifugieren und den Überstand vorsichtig entfernen. Resuspendieren Sie das konidische Pellet in 1 mL 100 mM Tris (Hydroxymethyl) Aminomethan-Hydrochlorid (Tris-HCl) pH 8,0 für 1 h, um das frei schwebende Biotin zu deaktivieren.
- 10 min bei 9.300 x g zentrifugieren und den Überstand vorsichtig entfernen. Waschen Sie das Pellet zweimal mit 1 mL sterilem PBS und resuspendieren Sie das Pellet in 1 mL PBS.
- Löse 1 mg Streptavidin-AF633 in 0,5 ml PBS auf, um eine Stammlösung von 2 mg/ml herzustellen. 10 μl 2 mg/ml Streptavidin-AF633 pro 1 ml konidialer Suspension zugeben und 40 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einer mit Aluminiumfolie bedeckten Wippe inkubieren. Das verbleibende Streptavidin-AF633 kann in Aliquoten eingefroren werden, um es in nachfolgenden Experimenten zu verwenden.
- 10 min bei 9.300 x g zentrifugieren und den Überstand vorsichtig entfernen. Resuspendieren Sie das Konidienpellet in 1 ml PBS und zählen Sie die Konidien mit einem Hämozytometer in einer Verdünnung von 1:1.000 (1:100 und dann 1:10). Die Konidienkonzentration mit CO2 -unabhängigen Medien auf 3,6 x 106/ml einstellen, in Folie einwickeln und bei 4 °C lagern.
Anmerkung: Die Konidien sind nun mit AF633 markiert und werden als FLuorescent Aspergillus REporter (FLARE) Konidien bezeichnet.
- Optional: Wenn eine Stimulation mit geschwollenen Konidien erforderlich ist, verdünnen Sie die Konidien nach dem Zählen der Konidien (Schritt 2.9) auf 7,2 x 106/ml in Hefestickstoffbasis (YNB) und geben Sie 500 μl Konidiensuspension zu 4,5 mL YNB-Medium in einem autoklavierten 50 mL Erlenmeyerkolben. Der Kolben wird abgedeckt und für 6 Stunden in einen Schüttelbrutkasten (200 U/min bei 37 °C) gestellt.
- Übertragen Sie das Medium in ein 15-ml-Röhrchen. Bei 805 x g für 10 min bei Raumtemperatur zentrifugieren und einmal in PBS waschen. Erneut zentrifugieren und das Pellet in 1 mL CO2 unabhängiges Medium resuspendieren, was 3,6 x 106 Konidien/ml.
ergibt
HINWEIS: Konidien verklumpen häufig, nachdem sie geschwollen sind, was eine genaue Zählung erschwert, es wird empfohlen, mit der gezählten Anzahl der verwendeten Ruhekonidien zu rechnen.
>3. Isolierung von humanen Neutrophilen und Monozyten
- Entnehmen Sie 20 ml venöses Blut von gesunden Probanden in zwei 10-ml-Blutröhrchen, die Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) enthalten. Gießen Sie für jeden Spender separat 20 ml Blut in ein 50-ml-Röhrchen und verdünnen Sie es mit 15 ml PBS.
- Unterlegen Sie das Blut mit 15 ml einer Lymphozytenisolationslösung (Dichte 1,077 g/ml) mit einer Spritze und einer Eisennadel. Platzieren Sie die Nadel am Boden des Röhrchens und drücken Sie die Lymphozytenisolationslösung vorsichtig heraus. Zentrifugieren Sie bei 630 x g für 20 min ohne Bremse und mit geringer Beschleunigung.
- PBS auf Eis gekühlt zubereiten.
Anmerkung: Die Schritte 3.4 und 3.5 müssen gleichzeitig befolgt werden, um Monozyten (3.4) und Neutrophile (3.5) zu erzeugen.
- Entnehmen Sie mit einer Pastette die Schicht der mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMC). Dies ist die Schicht in der Mitte zwischen dem gelben Serum (oben) und der transparenten Lymphozytenisolationslösung (untere) Schicht und wird in ein frisches 50-ml-Röhrchen überführt.
- Füllen Sie das Röhrchen mit dem PBMC bis zu 50 mL mit kaltem PBS und zentrifugieren Sie es bei 582 x g für 10 min. Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie es zweimal mit kaltem PBS und resuspendieren Sie 1 mL PBS pro 20 ml Spenderblut, das ursprünglich verwendet wurde.
- Nehmen Sie Verdünnungen im Verhältnis 1:10 für die Zählung vor, indem Sie 20 μl der Zellsuspension zu 160 μl PBS und 20 μl Trypanblau hinzufügen. Zählen Sie Zellen mit einem Hämozytometer.
- Bereiten Sie eine Pufferlösung vor, indem Sie 26 ml hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum (FCS) und 2,1 ml 0,5 M EDTA zu 500 ml Hanks ausgewogener Salzlösung (HBSS) hinzufügen. Die Zellen werden 10 min lang bei 515 x g zentrifugiert und in 40 μl Pufferlösung pro 1 x 107 Zellen resuspendiert.
- Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15-ml-Röhrchen und fügen Sie 10 μl CD14-Mikrokügelchen pro 1 x 107 Zellen hinzu, mischen Sie es gut und inkubieren Sie es 15 Minuten lang bei 4 °C, wobei Sie darauf achten, dass die Röhrchen alle 5 Minuten gemischt werden.
- Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 1 mL Pufferlösung pro 1 x 107 Zellen und zentrifugieren Sie sie 10 Minuten lang bei 515 x g.
- Der Überstand wird vollständig aspiriert und bis zu 1 x 108 Zellen in 500 μl Pufferlösung resuspendiert.
- 1 Säule pro Probe gemäß den Anweisungen des Herstellers auf einen Magnetabscheider legen. Waschen Sie die Säule zunächst einmal mit 500 μl Pufferlösung.
- Pipettieren Sie die 500 μl Zellsuspension durch die Säule, warten Sie, bis die Säule getrocknet ist, und waschen Sie dann, indem Sie dies dreimal mit Pufferlösung wiederholen.
- Legen Sie ein neues 15-ml-Röhrchen unter die Säule und nehmen Sie die Säule vom Magnetabscheider ab. Spülen Sie dann die Zellen aus der Säule in das Röhrchen mit 1 mL Pufferlösung.
- Fügen Sie 4 ml Pufferlösung hinzu und zentrifugieren Sie sie 10 Minuten lang bei 515 x g und resuspendieren Sie sie dann in 1 ml Medium des Roswell Park Memorial Institute (RPMI).
- Nehmen Sie Verdünnungen im Verhältnis 1:10 für die Zählung vor, indem Sie 20 μl der Zellsuspension zu 160 μl PBS und 20 μl Trypanblau hinzufügen. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.
- Stellen Sie die Zellkonzentration auf 6 x 105/ml mit RPMI ein und entkernen Sie 200 μl auf einer 35-mm-Bildgebungsschale auf Glasbasis. Über Nacht bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubieren.
- Entfernen Sie am nächsten Tag vor der Bildgebung den RPMI und fügen Sie 200 μl CO2-unabhängiges Medium hinzu.
Anmerkung: Diese Monozyten können auch vor der Bildgebung in verschiedene Makrophagen-Untergruppen differenziert werden. Wenn es sich um eine Technik handelt, die es zu erforschen gilt, ist eine kürzlich erschienene Arbeit von Ohradanova-Repic et al. ein hervorragender Ausgangspunkt.
- Entfernen Sie nach der Entnahme der PBMC-Schicht das gesamte Serum und den größten Teil der Lymphozyten-Isolationslösung, aber achten Sie darauf, das kleine weiße Band auf der Oberseite des roten Pellets nicht zu entfernen, da dies die meisten Neutrophilen enthält.
- Bereiten Sie ein 10x hypotonisches Lysepuffermaterial vor, indem Sie 83 g Ammoniumchlorid (NH4Cl) und 10 g Kaliumbicarbonat (KHCO3) in 1 l steriles Wasser geben. Bei 4 °C lagern.
- Verdünnen Sie diese Brühe 10x mit sterilem Wasser und geben Sie sie in die Röhrchen. Dann vorsichtig 3 Mal umdrehen und 15 min in Eis inkubieren.
- 10 min bei 394 x g zentrifugieren und 10 min in hypotonischem Lysepuffer in Eis resuspendieren.
- Bei 394 x g zentrifugieren und zweimal mit kaltem PBS waschen. Resuspendieren Sie in 1 mL CO2 -unabhängigem Medium pro Spender.
- Nehmen Sie Verdünnungen im Verhältnis 1:10 für die Zählung vor, indem Sie 20 μl der Zellsuspension zu 160 μl PBS und 20 μl Trypanblau hinzufügen. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.
- Für die Mikroskopie geben Sie 200 μl der gleichen Zellsuspension in eine 35-mm-Bildgebungsschale auf Glasbasis.
HINWEIS: Die Bildgebung oder Durchflusszytometrie von Neutrophilen sollte sofort eingeleitet werden, da sie dazu neigen, Apoptose zu durchlaufen, wenn sie nicht stimuliert werden. Wenn dies nicht möglich ist, sollten Neutrophile auf Eis gehalten und so schnell wie möglich (noch am selben Tag) verwendet werden.
>4. Live-Zellen-Videomikroskopie
HINWEIS: Die Wahl des Mikroskops hängt davon ab, was vor Ort verfügbar ist, aber der Mikroskopaufbau muss einen invertierten Tisch, eine auf 37 °C beheizte Klimakammer und geeignete Anregungs-/Emissionsfilter für dsRed (532/561 nm) und AF633 (633 nm) beinhalten. FLARE-Konidien funktionieren nicht mit dem 488-nm-Laser anstelle des 532/561-nm-Lasers für dsRed. Wenn Sie dieses Experiment zum ersten Mal durchführen, verwenden Sie die Kontrollkonidien ohne Farbe und mit einer Farbe, um die Hintergrundfluoreszenz und das Durchscheinen zwischen den Kanälen dsRed und AF633 zu testen.
- Schalten Sie die Heizung des Mikroskops vor dem Experiment ein und lassen Sie genügend Zeit, bis sich die Klimakontrollkammer auf 37 °C erwärmt hat. Die Zeit, die benötigt wird, bis sich die Kammertemperatur stabilisiert hat, variiert je nach Mikroskopaufbau.
- Schalten Sie das Mikroskop und den Computer ein, und laden Sie die Bildgebungssoftware. Montieren Sie die Bildgebungsschüssel auf dem Mikroskoptisch und stellen Sie den Fokus ein, um die menschlichen Neutrophilen oder Monozyten zu finden.
- Stellen Sie für dsRed und AF633 in den Aufnahmeeinstellungen die Laserleistung auf 10 % und die Belichtungszeit auf 1 s ein.
- Entfernen Sie den Objektträger und geben Sie 100 μl 3 x 106/ml FLARE-Konidiensuspension in die entsprechenden Vertiefungen (Gesamtvolumen 300 μl/Vertiefung). Notieren Sie die Zeit, zu der FLARE-Konidien in die Schale gegeben werden.
- Stellen Sie die Folie wieder auf die Bühne und passen Sie die Kameraempfindlichkeit für dsRed und AF633 an, um die Konidien deutlich zu sehen, aber das Bild nicht zu überbelichten. Richten Sie eine Etappenpunktliste ein, wenn eine Mehrpunkterfassung erforderlich ist.
- Beginnen Sie mit der Bildgebung, wenn alle Punkte scharf sind, die Kanäle optimiert und die Zykluszeit und -dauer eingestellt sind. Die Zykluszeit und die Dauer der Bildgebung hängen von der experimentellen Fragestellung ab. Ziel ist es, die Zykluszeit so kurz wie möglich zu halten (≤2 min) mit 1 min, um eine eingehende Analyse der Aufnahmedynamik zu ermöglichen.
