Verwendung von Bead-gestützten Lipiddoppelschichten zur Untersuchung der synaptischen Ausgabe von T-Zellen

Zusammenfassung

Quelle: Céspedes, P. F., et al. Vorbereitung von Bead-gestützten Lipiddoppelschichten zur Untersuchung der partikulären Ausstoßung von T-Zell-Immunsynapsen. J. Vis. Exp. (2022)

Dieses Video veranschaulicht die Rekonstitution von synthetischen Antigen-präsentierenden Zellen durch Bead-gestützte Lipid-Doppelschichten und ihre Anwendung bei der Bewertung der synaptischen Ausgabe, die von aktivierten T-Zellen erzeugt wird.

Protokoll

1. Kalibrierungen der Proteindichte auf BSLBs (Bead-supported lipid bilayers)

1. Vor der Entnahme der nicht funktionalisierten Siliziumdioxidkügelchen mit einem Durchmesser von 5,00 ±0,05 μm wird die Stammlösung gut gemischt und alle großen Klumpen von Kügelchen, die auf dem Boden der Kolben sedimentiert sind, resuspendiert.
   HINWEIS: Kieselsäurekügelchen neigen dazu, sich schnell zu sedimentieren, was zu Zählfehlern führen kann. Mischen Sie kräftig, indem Sie die Hälfte des maximalen Volumens einer P1000 Mikropipette nach oben und unten pipettieren.
2. Verdünnen Sie 1 μl Bead-Lösung in 1.000 μl PBS, zählen Sie die Beads mit einer Hämozytometerkammer und berechnen Sie ihre Konzentration pro ml.
   Anmerkung: Eine Trypanblau-Färbung ist für die Visualisierung von Siliziumdioxidkügelchen nicht erforderlich.
3. Berechnen Sie das Volumen der Kieselsäurekügelchen, die für 5 × 10⁵ endgültige BSLBs pro Punkt der Titration benötigt werden.
4. Übertragen Sie das erforderliche Volumen an Kieselsäurekügelchen in ein steriles 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
5. Waschen Sie die Kieselsäurekügelchen dreimal mit 1 mL sterilem PBS und zentrifugieren Sie die Kügelchen 15 s lang auf einer Tischmikrozentrifuge bei RT (bei fester Drehzahl).
   HINWEIS: Vermeiden Sie beim Entfernen der Waschlösung, das Perlpellet zu stören. Eine kleine Puffersäule hat keinen Einfluss auf die Ausbreitung der Liposomen, aus denen der Liposomen-Mastermix besteht, da diese auch in PBS enthalten sind.
6. Bereiten Sie drei Volumina des Liposomen-Mastermixes vor, um das BSLB auf die gewaschenen Kieselsäurekügelchen aufzusetzen (z. B. wenn das anfängliche Gesamtvolumen der Kieselsäurekügelchen 20 μl beträgt, bereiten Sie mindestens 60 μl des Liposomen-Mastermixes vor).
7. Für Biotinyl Cap PE Mol%-Titrationen
   1. Bereiten Sie die Lipid-Mastermixe vor, die 5-fache Verdünnungen von Biotinyl Cap PE enthalten.
      1. Verdünnen Sie die 0,4 mM Biotinyl Cap PE mol% in einer 100% DOPC-Matrix.
      2. Mischen Sie jeden Titrationspunkt von Biotinyl Cap PE mol% im Verhältnis 1:1 (vol: vol) mit einer Lösung von 0,4 mM 25 % DGS-NTA(Ni), so dass in allen Titrationen 12,5 mol% Ni-haltige Lipide vorhanden sind.
         Anmerkung: Die 12,5 mol% (vol:vol%) der Ni-haltigen Lipide stellen die gemischte Lipidzusammensetzung von BSLBs dar, an denen auch His-markierte Proteine in parallelen Kalibrierungen getestet werden können. Da beispielsweise alle Liposomenstämme mit der gleichen molaren Konzentration hergestellt werden, mischen Sie einfach 100 μl 25 mol% Ni-haltiges DGS-NTA mit 100 μl 100 mol% DOPC, um die Zielmol-%-Mischung in 200 μl der endgültigen Liposomenmischung zu erreichen.
   2. 5 × 10⁵ gewaschene Kieselsäurekügelchen werden in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführt, so dass pro Röhrchen ein Biotinyl Cap PE Mol%-Titrationspunkt montiert wird.
   3. Geben Sie die Biotinyl Cap PE Mol%-Titrations-Mastermixe zu den gewaschenen Kieselsäurekügelchen und mischen Sie vorsichtig, indem Sie die Hälfte des Gesamtvolumens auf und ab pipettieren. Vermeiden Sie die Bildung von Blasen, die im Übermaß die Lipiddoppelschicht zerstören.
   4. Geben Sie Argongas (oder Stickstoff) auf das Röhrchen, das die jetzt bildenden BSLBs enthält, um die Luft zu verdrängen und die Lipide vor Oxidation während des Mischens zu schützen.
   5. Geben Sie vor der Lagerung Argon zu den 0,4 mM Lipidvorräten und manipulieren Sie sie mit einer sterilen Technik.
      Anmerkung: Schließen Sie einen kleinen Schlauch an die Argon/Stickstoff-Gasflasche an. Stellen Sie vor dem Hinzufügen von Gas zu den Rohren den Gasflaschenregler so ein, dass der Druck nicht höher als 2 psi eingestellt wird. Schließen Sie eine sterile Pipettenspitze an den Auslassschlauch an, um den Gasstrom 5 Sekunden lang in den Liposomenschaft zu leiten und den Deckel schnell zu schließen. Bei Lipiden ist der Deckel der Tube vor der Lagerung bei 4 °C mit Paraffinfolie zu verschließen.
   6. Bewegen Sie die BSLBs in einen vertikalen Labormischer mit variablem Winkel (siehe Materialtabelle) und mischen Sie 30 Minuten lang bei RT mit einer orbitalen Mischung von 10 U/min.
      Anmerkung: Dieser Schritt verhindert die Sedimentation von Kügelchen während der Bildung der gestützten Lipiddoppelschicht.
   7. Schleudern Sie die Kügelchen herunter, indem Sie sie 15 s lang bei RT auf einer Tisch-Minizentrifuge zentrifugieren und dann dreimal mit 1 ml HBS/HSA (BSA) waschen, um überschüssige Liposomen zu entfernen.
   8. Blockieren Sie die gebildeten BSLBs durch Zugabe von 1 ml 5 % Kasein oder 5 % BSA mit 100 μM NiSO₄ zur Sättigung der NTA-Stellen und 200 nM Streptavidin, um alle Biotin-Verankerungsstellen auf den BSLBs gleichmäßig zu beschichten. Mischen Sie vorsichtig, indem Sie die Hälfte des Gesamtvolumens auf und ab pipettieren und nicht länger als 20 Minuten bei RT und 10 U/min im Vertikalmischer inkubieren.
   9. Schleudern Sie die BSLBs herunter, indem Sie 15 s lang bei RT auf einer Tisch-Minizentrifuge zentrifugieren und dann dreimal mit 1 ml HBS/HSA (BSA)-Puffer waschen.
      Anmerkung: Halten Sie die gewaschenen Kügelchen vertikal mit einer kleinen Menge Waschpuffer, um die BSLBs zu bedecken. Vermeiden Sie die Austrocknung der BSLBs, da Luft die Lipiddoppelschicht zerstört
   .
8. Für die Titration von His-markierten Proteinen auf 12,5 mol% der DGS-(Ni) NTA-haltigen BSLBs
   1. Bereiten Sie drei Volumina Liposomen-Mastermix vor, die die letzten 12,5 Mol-% DGS-NTA(Ni) enthalten.
   2. Verwenden Sie den Liposomen-Mastermix, um die gewaschenen Kieselsäurekügelchen zu resuspendieren, und mischen Sie vorsichtig, indem Sie die Hälfte des Gesamtvolumens auf und ab pipettieren. Vermeiden Sie die Bildung von Blasen, die die Lipiddoppelschicht übermäßig schädigen.
   3. Geben Sie Argongas (oder Stickstoff) auf das Röhrchen, das die jetzt bildenden BSLBs enthält, um die Luft zu verdrängen und die Lipide vor Oxidation während des Mischens zu schützen.
   4. Geben Sie vor der Lagerung Argon zu den 0,4 mM Lipidvorräten und manipulieren Sie sie mit einer sterilen Technik.
   5. Bewegen Sie die BSLBs in den vertikalen Mischer und mischen Sie 30 Minuten lang bei RT mit Orbitalmischung bei 10 U/min.
   6. Schleudern Sie die Kügelchen herunter, indem Sie sie 15 s lang bei RT auf einer Tisch-Minizentrifuge zentrifugieren und dann dreimal mit 1 ml HBS/HSA (BSA) waschen, um überschüssige Liposomen zu entfernen.
   7. Blockieren Sie die gebildeten BSLBs, indem Sie 1 ml 5 % Kasein (oder 5 % BSA) mit 100 μM NiSO4 hinzufügen, um die NTA-Stellen auf den BSLBs zu sättigen. Vorsichtig mischen und nicht länger als 20 Minuten bei RT und 10 U/min im vertikalen Mischer inkubieren.
   8. Waschen Sie dreimal mit HBS/HSA (BSA), um die überschüssige Blocklösung zu entfernen.
   9. Bereiten Sie in einer neuen 96-Well-Platte mit U-Boden 2-fache serielle Verdünnungen der Proteine vor.
      1. Bereiten Sie eine Ausgangskonzentration von 100 nM für das interessierende Protein in einem Gesamtvolumen von 200 μl HBS/HSA (BSA)-Puffer vor, verteilen Sie 100 μl dieser Lösung in der ersten Säule und die restlichen 100 μl auf Spalte #2, die 100 μl HBS/HSA (BSA)-Puffer enthält.
      2. Fahren Sie fort, indem Sie 100 μl seriell von Spalte #2 in Spalte #3 übertragen und bei Bedarf wiederholen, um alle Titrationspunkte abzudecken. Lassen Sie die letzte Spalte der Reihe ohne Protein, da dies als leere Referenz für die Quantifizierung verwendet wird.
   10. Die vorbereiteten BSLBs werden in einem Volumen resuspendiert, in dem 5 × 10⁵ BSLB in 100 μl HBS/HSA (BSA)-Puffer enthalten sind.
   11. 100 μl der BSLB-Suspension werden in Vertiefungen einer zweiten 96-Well-Platte mit U-Boden übertragen, so dass jede Vertiefung 5 × 10⁵ BSLBs erhält.
   12. Die zweite Platte mit den BSLBs wird 2 min lang bei 300 × g und RT heruntergedreht und der Überstand entsorgt.
   13. Übertragen Sie die 100 μl Volumina von der Proteintitrationsplatte auf die Platte mit den sedimentierten BSLBs. Mischen Sie vorsichtig, vermeiden Sie die Bildung von übermäßigen Blasen beim Pipettieren und inkubieren Sie 30 Minuten lang bei RT und 1.000 U/min mit einem Plattenschüttler. Mit Alufolie vor Licht schützen.
   14. Waschen Sie die Platte dreimal mit HBS/HSA (BSA)-Puffer in Sedimentationsschritten von 300 × g für 2 min bei RT.
   15. Wenn das in der Kalibrierung verwendete rekombinante Protein direkt an Fluorochrome konjugiert ist und bekannte F/P-Werte aufweist.
   16. Wenn das in der Kalibrierung verwendete rekombinante Protein nicht markiert oder an Fluorochrome konjugiert ist oder kein MESF-Bead-Standard verfügbar ist, verwenden Sie Alexa Fluor 488- oder 647-konjugierte Antikörper mit bekannten F/P-Werten, um das proteinbeschichtete BSLB zu färben.
   17. Färben mit Sättigungskonzentrationen von Quantifizierungs-Antikörpern.
       HINWEIS: Je nach Zielexpressionsniveau liegen diese zwischen 5 und 10 μg/ml.
   18. 30 min bei RT und 1.000 U/min mit einem Plattenschüttler färben. Mit Aluminiumfolie vor Licht schützen.
   19. Zweimal mit HBS/HSA (BSA) Puffer und einmal mit PBS in Sedimentationsschritten von 300 × g für 2 min bei RT.
       waschen Anmerkung: Verwenden Sie PBS, pH 7,4, um die gewaschenen BSLBs vor dem Erwerb zu resuspendieren. Verwenden Sie keine proteinhaltigen Puffer, da dies beim automatischen Mischen von Proben mit Hochdurchsatz-Probenehmern zur Blasenbildung führt.
   20. Erfassen Sie die MESF-Standards, und stellen Sie sicher, dass die hellsten Peaks im linearen Nachweisbereich für den Quantifizierungsdetektor (Kanal) bleiben, wie in Abbildung 1B (vii) gezeigt.
   21. Entnehmen Sie die Proben manuell oder mit HTS. Wenn Sie letzteres verwenden, resuspendieren Sie BSLBs in 100 μl PBS und erfassen Sie 80 μl mit einer Flussrate zwischen 2,5 und 3,0 μl/s, einem Mischvolumen von 100 μl (oder 50 % des Gesamtvolumens, wenn das Resuspensionsvolumen kleiner ist), einer Mischgeschwindigkeit von 150 μl/s und fünf Mischungen, um sicherzustellen, dass die BSLBs monodispergiert sind.
   22. Exportieren Sie die FCS-Dateien.
   23. Konzentrieren Sie sich bei den Analysen auf einzelne Ereignisse (Abbildung 2A), da Dubletten oder Tripletts zu Fehlern in der Bestimmung führen. Verwenden Sie die verschachtelte Identifizierung einzelner Ereignisse, wie in Protokollschritt 1.2.3 beschrieben.
   24. Messen Sie den MFI jeder MESF-Fraktion (1-4) und subtrahieren Sie den MFI der leeren Kügelchen, um korrigierte MFIs (cMFI) zu extrahieren.
   25. Führen Sie eine lineare Regressionsanalyse durch, um die Steigung (b) des MESF über den für MESF-Standards berechneten cMFI zu extrahieren.
   26. Extrahieren Sie den MFI jedes Titrationspunkts und subtrahieren Sie den MFI von Kügelchen ohne Protein, um cMFIs zu erhalten.
   27. Dividieren Sie die cMFIs durch die Steigung, die berechnet wurde, um die an BSLBs gebundene MESF für jeden Titrationspunkt zu extrahieren.
   28. Dividieren Sie MESF, das an BSLBs gebunden ist, durch den F/P-Wert des Quantifizierungsantikörpers, um die durchschnittliche Anzahl der pro BSLB gebundenen Moleküle zu extrahieren.
   29. Extrahieren Sie unter Verwendung des Durchmessers der BSLBs (5,00 ± 0,05 μm) die Bead-Oberfläche (SA = 4pr2), um die endgültigen Dichten des Proteins (molec./^{μm 2}) pro Titrationspunkt (Proteinkonzentration) zu berechnen.
   30. Führen Sie eine neue Regressionsanalyse der Proteinkonzentration über die Proteindichte durch, um die Steigung (b) der Linie der besten Anpassung zu berechnen.
       Anmerkung: Die Konzentration von 12,5 mol% DGS-NTA(Ni) verleiht eine maximale Verankerungskapazität von etwa 10.000 molec./μm2 10, ohne die unspezifische Aktivierung von T-Zellen zu induzieren oder die laterale Beweglichkeit der SLBs zu beeinträchtigen.

>2. Durchführung von synaptischen Transferexperimenten zwischen T-Zellen und BSLBs

1. Vor dem Ausführen des synaptischen Transferexperiments
   1. Erwerben Sie nicht fluoreszierende BSLBs, BSLBs mit fluoreszierenden Lipiden, ungefärbte Zellen (oder Kompensationsperlen; siehe Materialtabelle) und einfarbig gefärbte Zellen (oder Kompensationsperlen), um die Wechselwirkungen des Geräts mit dem Fluoreszenzspektrum zu identifizieren. Konzentrieren Sie sich auf Detektoren mit hoher Spillover-Spreizung, um das polychromatische Panel neu zu gestalten, die Empfindlichkeit zu erhöhen und den Messfehler bei kritischen Detektoren zu reduzieren.
   2. Titrieren Sie die Nachweisantikörper, um die optimale Konzentration zu ermitteln und so die Erkennung positiver Ereignisse zu ermöglichen, ohne die Erkennung negativer Ereignisse zu beeinträchtigen.
      Anmerkung: Wiederholen Sie diesen Schritt, wenn sich die Antikörpercharge ändert, da die F/P-Werte und die Helligkeit von Charge zu Charge variieren.
   3. Optional: Optimieren Sie die PMT-Spannungen, indem Sie die Probe in verschiedenen Spannungsbereichen erfassen (d. h. einen Spannungsgang), um die PMTs zu finden, die zu einem optimalen Signal-über-Rauschen führen (d. h. Trennung von Negativen und Positiven, während sichergestellt wird, dass das Signal der hellsten Population im linearen Bereich bleibt).
2. Messung der Übertragung des T-Zellen-Ausgangs an BSLBs
   1. Bereiten Sie ergänztes RPMI 1640 (hierin R10-Medium) vor, das 10 % hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum (FBS), 100 μM nicht-essentielle Aminosäuren, 10 mM HEPES, 2 mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin enthält. Verwenden Sie das R10-Medium, um T-Zellen zu kultivieren und zu expandieren.
   2. Isolieren Sie an Tag 1 T-Zellen aus Kammern des peripheren Blutes oder des Leukoreduktionssystems (LRS). Verwenden Sie Isolations- und Separationskits für Immundichtezellen (siehe Materialtabelle) für die Anreicherung von humanen CD4+- und CD8+-T-Zellen.
   3. Aussaat der Zellen in einer Endkonzentration zwischen 1,5 und 2,0 × 10⁶ Zellen/ml unter Verwendung von 6-Well-Platten mit insgesamt nicht mehr als 5 mL pro Well.
   4. Aktivieren Sie T-Zellen mit einem Verhältnis von 1:1 aus magnetischen Beads zur Aktivierung menschlicher T-Zellen (Anti-CD3/Anti-CD28) (siehe Materialtabelle) und fügen Sie 100 IE rekombinantes humanes IL-2 hinzu, um die Zellproliferation und das Überleben zu unterstützen.
   5. Entfernen Sie an Tag 3 die aktivierenden Magnetkügelchen mit Magnetsäulen (siehe Materialtabelle). Stellen Sie sicher, dass magnetische Kügelchen an den Seiten des Röhrchens haften, bevor Sie die Zellen für weitere Waschschritte zurückgewinnen.
   6. Waschen Sie die magnetischen Kügelchen noch einmal mit 5 ml frischem R10-Medium, mischen Sie sie gut und legen Sie sie wieder in den Magneten. Nehmen Sie dieses Volumen zurück und mischen Sie es mit den in Schritt 1.2.5 gewonnenen Zellen.
   7. Resuspendieren Sie die Zellen auf 1,5-2 × 10⁶ Zellen/ml in frischem R10, das 100 U/ml IL-2 enthält. Füllen Sie das Medium nach 48 Stunden wieder auf und stellen Sie sicher, dass die letzte Zugabe von IL-2 48 Stunden vor dem Tag des Experiments (Tag 7 bis 14 der Kultur) liegt.
   8. Bereiten Sie am Tag des synaptischen Transferexperiments das Synaptic Transfer Assay-Medium vor, indem Sie phenolrotfreies RPMI 1640-Medium mit 10 % FBS, 100 μM nicht-essentiellen Aminosäuren, 2 mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin ergänzen. Rekombinantes humanes IL-2 ist nicht enthalten.
   9. Zählen Sie die Zellen entweder mit Trypanblau-Färbung oder elektrischem Stromausschluss und resuspendieren Sie sie auf eine Endkonzentration von 2,5 × 10⁶ Zellen/ml im Medium. Wenn ein übermäßiger Zelltod (>10%) beobachtet wird, entfernen Sie tote/sterbende Zellen mit einer Mischung aus Polysaccharid und Natriumdiatrizoat (siehe Materialtabelle) wie folgt:
      1. Schichten Sie 15 ml Zellkultur auf 13 ml der Polysaccharid-Natriumdiatrizoat-Lösung.
      2. Zentrifugieren Sie 1.250 × g für 20 min bei RT mit minimaler Beschleunigung und Beschleunigung. Sammeln Sie die Zellschicht (Wolke) in der Grenzfläche zwischen dem Medium und der Polysaccharid-Natriumdiatrizoat-Lösung.
      3. Die Zellen werden mindestens zweimal mit einem vorgewärmten Synaptic Transfer Assay-Medium (hergestellt in Schritt 1.2.7) gewaschen.
      4. Zählen und resuspendieren Sie die Zellen bis zu einer Endkonzentration von 2,5 × 10⁶/ml unter Verwendung eines Synaptic Transfer Assay-Mediums. 100 μl dieser Zellsuspension mit BSLBs kokulturieren (siehe Schritt 1.2.15).
   10. Berechnen Sie die Anzahl der für das Experiment benötigten BSLBs; berücksichtigen Sie alle verschiedenen Protein-Mastermixe und Antigentitrationen, die getestet werden sollen (entweder biotinylierte HLA/MHC-Peptid-Monomere oder monobiotinylierte anti-CD3ε Fab).
   11. Assemblieren Sie die BSLBs, indem Sie die gleichen Schritte wie in Protokollabschnitt 5 befolgen, aber kombinieren Sie diesmal alle Titrationen von Proteinen und Lipiden, die zur Rekonstitution einer komplexen APC-Membran erforderlich sind (Abbildung 3A). Behalten Sie die gleichen Vol:Vol-Beziehungen zwischen dem anfänglichen Volumen der Siliziumdioxidkügelchen und dem Volumen der Proteinmischung bei, die während der Kalibrierung verwendet wurde, sowie den Zeiten und Temperaturen, die bei der Beladung von BSLBs verwendet wurden. Wenn beispielsweise 0,5 μl Siliziumdioxidkügelchen/Vertiefung und 100 μl/Vertiefung Proteinmischung für die Erstkalibrierung verwendet wurden, ist ein Verhältnis von 5:1.000 vol:vol einzuhalten, um die BSLBs für die Kokultivierung mit T-Zellen vorzubereiten.
   12. Sobald die BSLBs mit dem gewünschten Proteinmix beladen wurden, waschen Sie die BSLBs zweimal mit HBS/HSA (BSA), um überschüssige ungebundene Proteine zu entfernen. In jedem Waschschritt sind Sedimentationsgeschwindigkeiten von 300 × g für 2 min bei RT zu verwenden und die Überstände zu entsorgen.
   13. Resuspendieren Sie die 5 × 105 BSLB pro Vertiefung in 200 μl.
   14. Übertragen Sie 100 μl pro Vertiefung auf eine neue 96-Well-Platte mit U-Boden, um ein Duplikat zu erstellen, sodass die endgültige Menge an BSLB pro Vertiefung 2,5 × 10⁵ beträgt.
   15. Schleudern Sie die BSLBs bei 300 × g für 2 min und RT herunter und werfen Sie den Überstand weg.
   16. Resuspendieren Sie die BSLBs mit 100 μl T-Zell-Suspension; mischen Sie vorsichtig, um die Bildung von Blasen zu verhindern.
   17. Inkubieren Sie die Kokulturen für 90 min bei 37 °C.
       Anmerkung: Alternativ können Zellen und Kügelchen in HBS/HSA (BSA)-Puffer anstelle von phenolrotfreiem RPMI für die Kokultur resuspendiert werden. In diesem Fall muss die Inkubation in einem Nicht-CO₂ -Inkubator durchgeführt werden, da dieses Gas den Puffer in Abwesenheit von Bikarbonat schnell ansäuert.
   18. Kühlen Sie die BSLB-T-Zell-Kokulturen ab, indem Sie die Zellen zunächst mindestens 15 Minuten lang bei RT inkubieren. Schützen Sie sie vor Licht.
   19. Die Zellen werden 5 Minuten lang bei 500 × g und RT zentrifugiert; der Überstand wird verworfen.
   20. Resuspendieren Sie die Zellen in RT 2% BSA-PBS (Ca₂⁺ und Mg₂⁺-frei) zur Blockierung. Legen Sie die Zellen für 45 Minuten auf Eis. Vor Licht schützen.
   21. Bereiten Sie während der Inkubation der Zellen den Antikörper-Mastermix mit eiskaltem 0,22 μm gefiltertem 2 % BSA in PBS als Färbepuffer vor, der für eine zusätzliche Blockierung sorgt.
       Anmerkung: Einige Chargen von Antikörpern, die an Brilliant Violet-Farbstoffe konjugiert sind, neigen dazu, unspezifisch an BSLBs zu binden. Die Blockierung mit 5 % BSA-PBS hilft, dieses Rauschen zu reduzieren. Achten Sie von nun an darauf, dass die Kühlkette nicht unterbrochen wird.
   22. Die Kokulturen bei 500 × g 5 min und 4 °C einschmelzen lassen. Bevor Sie die Überstände entsorgen, vergewissern Sie sich kurz, dass das Pellet vorhanden ist, indem Sie den Boden der 96-Well-Platte mit einer Hintergrundbeleuchtung inspizieren.
   Mit
   23. einer Mehrkanalpipette resuspendieren Sie die Zellen im Färbe-Mastermix mit optimierten Antikörperkonzentrationen.
       Anmerkung: Verwenden Sie Pipettenspitzen ohne Filter, um die Bildung von Blasen und Fehler bei der Verteilung des Färbevolumens zu vermeiden.
   24. Dazu gehören isotypmarkierte Zellen und BSLBs, fluoreszierende und nicht fluoreszierende BSLBs sowie Zellen und BSLBs, die allein gefärbt wurden. Die Gesamtzahl der Ereignisse pro Vertiefung ist für alle Kontrollen zu beachten (d. h. nur BSLBs mit 5 × 10⁵ BSLB/Vertiefung und nur Zellkontrollen mit 5 × 10⁵ Zellen/Vertiefung, um einen relativen Anstieg der Antikörper pro gefärbtem Ereignis zu vermeiden).
   25. Mischen Sie vorsichtig, indem Sie die Hälfte des Volumens auf und ab pipettieren und 30 Minuten lang auf Eis inkubieren. Vor Licht schützen.
   26. Waschen Sie die Zellen und BSLBs zweimal mit eiskaltem 2 % BSA-PBS, pH 7,4 und Sedimentationsschritten von 500 × g für 5 min bei 4 °C. Resuspendieren Sie die gewaschenen Kokulturen in 100 μl PBS und nehmen Sie sie sofort auf.
   27. Wenn eine Fixierung erforderlich ist, 10 Minuten lang mit 0,5 % w/v PFA in PBS fixieren, einmal waschen und bis zur Aufnahme in PBS aufbewahren. Vor Licht schützen.
   28. Erwerben Sie vor der Kompensation MESF-Standards, um sicherzustellen, dass sowohl die dunkelsten als auch die hellsten Populationen in den linearen Messbereich fallen.
   29. Erfassen Sie Kompensationsproben, berechnen Sie die Kompensation und wenden Sie die Kompensationsmatrix (Link) auf das Experiment an.
   30. Erfassen und speichern Sie mindestens 2 × 10 4 MESF-Standards für jeden der Quantifizierungskanäle.
   31. Für die Erfassung mit Hochdurchsatz-Probenehmern ist die Geräteerfassung auf Standard einzustellen, die Probenerfassung auf 80 μl (oder 80 % des Gesamtvolumens), die Probenflussrate zwischen 2,0 und 3,0 μl/s, das Probenmischvolumen auf 50 μl (oder 50 % des Gesamtvolumens, um die Blasenbildung während des Mischens zu vermeiden), die Probenmischung auf 150 μl/s einzustellen, und Mischen pro Vertiefung zwischen 3 und 5.
   32. Erfassen Sie mindestens 1 × 10⁴ Einzel-BSLBs pro Probe (siehe Abbildung 3B-Felder (i)-(vi) für die Referenz-Gating-Strategie).
   33. Waschen Sie das Zytometer 5 Minuten lang mit einer Reinigungslösung, gefolgt von 5 Minuten Reinstwasser, bevor Sie das Gerät ausschalten. Wenn Sie das HTS verwenden, folgen Sie den Optionen unter dem Reiter HTS und der Option Reinigen.
   34. FCS-Dateien exportieren.

>3. Messung des synaptischen Transfers von Partikeln zu BSLBs

1. Öffnen Sie die FCS-Dateien des Experiments. Wählen Sie die Population von Zellen und BSLBs basierend auf ihren seitlichen und vorderen Lichtstreubereichen (SSC-A versus FSC-A) aus, wie in Abbildung 3B (i) gezeigt.
2. Wählen Sie die Ereignisse innerhalb des kontinuierlichen Erfassungsfensters aus (Abbildung 3B (ii)).
3. Fokussierung auf die Einzelereignisse beider Zellen und BSLB; Identifizierung einzelner Zellen zuerst anhand des niedrigen W in den sequentiellen Gattern FSC-W/FSC-H (Singulett-1, Abbildung 3B Panel (iii)) und SSC-W/SSC-H (Singuletts-2; Abbildung 3B-Tafel (iv)). Definieren Sie ein zusätzliches Singulett-3-Gatter, indem Sie Events mit proportionalem FSC-A und FSC-H auswählen (Abbildung 3B, Panel (v)).
4. Extrahieren Sie den MFI der MESF-Fraktionen blank und 1 bis 4 sowie aus einzelnen Zellen und MESF für jede Versuchsprobe.
5. Generieren Sie korrigierte MFI-Werte (cMFI) für die MESF-Fraktionen 1 bis 4, indem Sie den MFI der Blindkugelpopulation von jeder Fraktion subtrahieren.
6. Generieren Sie cMFIs für einzelne BSLBs und Zellen (siehe Abbildung 3C Panel (i)).
7. Verwenden Sie das Signal von BSLB, das mit Isotyp-Kontrollantikörpern gefärbt wurde, um die MFI von BSLB zu korrigieren, die mit Antikörpern gegen die relevanten T-Zell-Marker gefärbt wurden. Verwenden Sie cMFI, um den normalisierten synaptischen Transferprozentsatz (NST%) zu berechnen, indem Sie die Gleichung verwenden, die in Abbildung 3C (ii) gezeigt ist.
8. Wenn Sie stattdessen an den Teilchen interessiert sind, die spezifisch als Reaktion auf die TCR-Triggerung übertragen werden, subtrahieren Sie das Signal von Null-BSLBs vom MFI agonistischer BSLBs. Verwenden Sie diesen cMFI, um den TCR-gesteuerten NST% zu berechnen, indem Sie die Gleichung verwenden, die in Abbildung 3C (ii) gezeigt ist.
9. Wenn Sie daran interessiert sind, die Gesamtzahl der Moleküle zu bestimmen, die als Partikelfracht über die T-Zelle-BSLB-Grenzfläche übertragen werden, erfassen Sie MESF-Benchmark-Kügelchen mit den gleichen Geräteeinstellungen und der gleichen Erfassungssitzung für T-Zell-BSLB-Kokulturen.
10. Analysieren Sie MESF-Bead-Populationen und extrahieren Sie ihre cMFIs. Berechnen Sie die Steigung der Geraden der besten Anpassung für die Regressionsanalyse von MESF über cMFI.
11. Verwenden Sie die berechnete Steigung, um die Anzahl der MESF zu extrahieren, die auf BSLBs abgelagert wurden. Verwenden Sie cMFIs, die entweder mit Isotypkontrollen oder Null-BSLB als Leerzeichen berechnet wurden, um die Anzahl der MESF zu extrahieren, die speziell an stimulierende BSLBs übertragen wurden.
12. Berechnen Sie die Anzahl der Moleküle von Markern, die auf BSLBs übertragen werden, indem die berechneten (durchschnittlichen) MESFs pro BSLB durch den F/P-Wert des Quantifizierungsantikörpers dividiert werden.

Ergebnisse

Abbildung 1: Absolute Quantifizierung von Proteinen auf der Oberfläche von APCs. (A) Beispiel für quantitative Durchflusszytometrie-Messungen von ICAM-1 auf der Oberfläche von tonsillären B-Zellen (Foll. Bc) und T-Helferzellen (TFH). (i-vii) Gating-Strategie zur Analyse von einzelnen CXCR5+ Bc und TFH, die aus menschlichen Gaumenmandeln isoliert wurden. Dargestell...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
96 Well Cell Cultture Platte U-Boden mit Deckel, Gewebekultur behandelt, pyrogenfrei	Costar®	3799	Für die FCM-Färbung und Co-Kultur von BSLB und Zellen.
96 Well Cell Cultture Platte V-Boden mit Deckel, Gewebekultur behandelt, nicht pyrogen.	Costar®	3894	Für die FCM-Färbung von Zellen oder Kügelchen in Suspension.
Alexa Fluor 488 NHS-Ester (Succinimidylester)	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™	Nr. A20000
Alexa Fluor 647 NHS-Ester (Succinimidylester)	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™	A37573 und A20006
Multiwell 6 Well: Gewebekultur, behandelt mit Vakuum-Gas-Plasma	Falke	353046	Zur Kultivierung und Expansion von gereinigten CD4+ und CD8+ T-Zellen.
Kasein aus Rindermilch, geeignet als Substrat für Proteinkinase (nach Dephosphorylierung), gereinigtes Pulver
Dynabeads T-Aktivator CD3/ CD28	ThermoFisher Scientific, Gibco	11132D
DynaMag-2	ThermoFisher Scientific, Invitrogen™	12321D	Zur Entfernung von Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 in Volumina von weniger als 2 mL
DynaMag-15™	ThermoFisher Scientific, Invitrogen™	12301D	Zur Entfernung von Dynabeads™ Human T-Activator CD3/CD28 in Volumina von weniger als 15 mL
Qualifiziertes fötales Rinderserum, ein Sho	ThermoFisher Scientific, Gibco	A3160801	Benötigt eine Wärmeinaktivierung für 30 min bei 56 oC
Anti-Human-CD154 (CD40L), Klon 24-31	BioLegende	310815 und 310818	Alexa Fluor 488 bzw. Alexa Fluor 647 Konjugate
Armenischer Hamster IgG Alexa Fluor 647 Isotyp-Steuerung, Klon HTK888	BioLegende	400902	Im Haus mit Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidylester) markiert
BD Zytometer Setup und Tracking Beads	Becton Dickinson & Company (BD)	641319	Performance-Track der Instrumente vor quantitativer FCM