Die folgende Methode ist angepasst, um Konkurrenzstämme mit Inhibitor-produzierenden Stämmen zu testen.
HINWEIS: Dieses Protokoll beinhaltet die Erzeugung von Aerosolen mit Bakterienkulturen. Dies kann nur in einem geschlossenen Raum unter Berücksichtigung lokal anerkannter Sicherheitsaspekte durchgeführt werden. Das Sprühen der Kultur auf die Agarplatten in einer Sicherheitswerkbank der Stufe 2 minimiert die Kontamination der Agarplatten und der Umgebung. Dies schützt den Forscher auch vor der Inhalation der gesprühten Bakterien durch Aerosole, was ein großes Problem darstellt, wenn der Forscher Organismen der Eindämmungsstufe 2 verwendet. Es muss eine geeignete persönliche Schutzausrüstung getragen werden. Der Bereich um die Petrischale wird am besten mit einem saugfähigen Einwegtuch abgedeckt. Eine Dekontamination nach dem Sprühen mit UV-Licht wird empfohlen.
>1. Vorbereiten der Agarplatten
- Bereiten Sie Gehirn-Herz-Infusions-Agar (BHI) gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.
- Autoklavieren Sie den BHI-Agar bei 121 °C, 15 Pfund Kraft pro Quadratzoll (psi) für 20 Minuten oder gemäß den Empfehlungen des Autoklavenherstellers, um ihn zu sterilisieren.
- 15 ml aliquote sterilisierter BHI-Agar in sterile Petrischalen füllen und fest werden lassen.
Anmerkung: Stellen Sie sicher, dass jede Agarplatte, die im Assay verwendet werden soll, aus demselben Agarbestand stammt und dass sich in jeder Platte die gleiche Menge Agar befindet. Dies begrenzt die Variabilität der verfügbaren Nährstoffe und die Inhibitordiffusion zwischen den Platten und ermöglicht so eine Vergleichbarkeit.
>2. Sterile Brühe zubereiten
- Bereiten Sie die BHI-Brühe gemäß den Anweisungen des Herstellers zu.
- Geben Sie 10 ml Aliquots BHI in 28 ml Universalflaschen aus Glas.
- Autoklavieren Sie die BHI-Brühe bei 121 °C, 15 psi für 20 Minuten oder gemäß den Empfehlungen des Autoklavenherstellers, um sie zu sterilisieren.
Anmerkung: Stellen Sie sicher, dass die gesamte im Assay verwendete Brühe aus derselben Brühecharge stammt, die gleichzeitig autoklaviert wurde, um Schwankungen der Nährstoffe zu begrenzen, die zu Abweichungen in den Ergebnissen führen könnten.
>3. Sterile Verdampferflasche(n) vorbereiten
- Demontieren Sie die Vaporizer-Flasche.
- Sprühen Sie 5 % oberflächenaktives Reinigungsmittel durch den Vaporizer, um interne Verunreinigungen zu entfernen, und tränken Sie die Vaporizerflasche, den Deckel und den Vaporizer über Nacht in dem 5 % oberflächenaktiven Reinigungsmittel.
Anmerkung: Beim Umgang mit oberflächenaktiven Reinigungsmitteln sollten Handschuhe und geeignete persönliche Schutzausrüstung verwendet werden.
- Trocknen Sie den Vaporizer, den Deckel und die Flaschen unter einer sterilen Luftstromhaube.
- Füllen Sie die Flasche mit 70% Ethanol, schließen Sie den Verdampfer wieder an und sprühen Sie etwas Ethanol durch den Verdampfer.
- Setzen Sie den Deckel auf den Verdampfer und bewahren Sie das Ethanol bis zur Verwendung darin auf.
- Spülen Sie die Flasche unmittelbar vor dem Gebrauch aseptisch mit steriler BHI-Brühe aus und sprühen Sie die Brühe durch den Verdampfer.
Anmerkung: Dadurch wird verhindert, dass das Ethanol das Inokulum beeinflusst, das der Flasche gemäß Abschnitt 6.3 zugesetzt wurde.
4. Vorbereiten der bakteriellen Übernachtkultur(en)
- Die Stämme des Mitbewerbers und des Inhibitors werden auf eine sterile BHI-Agarplatte aufgetragen und bei 37 °C aerob für ca. 18 Stunden (über Nacht) inkubiert.
Anmerkung: Diese Platte produziert einen Bakterienbestand, der bei einer Lagerung bei 4 °C für mehrere Replikate innerhalb derselben Woche verwendet werden kann.
- Impfen Sie 10 ml sterile BHI-Bouillon mit einer einzigen Kolonie des gewünschten Bakterienstamms von Mitbewerbern in einer 28-ml-Universalflasche.
- Inkubieren Sie die Universalflasche bei 37 °C aerob über Nacht, indem Sie sie bei 250 U/min in einem Orbitalschüttler schütteln.
>5. Spot-Kultur des Inhibitor-produzierenden Isolats
- Bereiten Sie die Kultur(en) über Nacht wie in Abschnitt 4 beschrieben vor.
- Stellen Sie vor der Inokulation sicher, dass die Agarplatten vollständig trocken sind und kein Kondenswasser auf dem Deckel vorhanden ist (z. B. durch 60-minütige Inkubation der Platte bei 37 °C). Dies verhindert, dass sich das Inokulum von der Impfstelle aus über die Platte ausbreitet.
- Pipettieren Sie 25 μl der Übernachtkultur in die Mitte der Agarplatten. Vermeiden Sie es, den Pipettenkolben vollständig zu drücken, um Luftblasen zu vermeiden, die die Kultur über den Agar sprühen.
- Lassen Sie die Kultur bei Raumtemperatur trocknen, um die Ausbreitung der Kultur zu begrenzen. Inkubieren Sie die Agarplatten bei 37 °C aerob über Nacht.
>6. Vorbereiten des Sprühinokulums des/der Testkonkurrenzstämme(s)
- Bereiten Sie die Übernachtkultur wie in Abschnitt 4 beschrieben vor. Verdünnen Sie die Übernachtkultur 10-fach in BHI-Bouillon, um etwa 4 x 106 koloniebildende Einheit (KBE) ml-1 und eine Suspension von OD600 0,3 ±0,05.
zu erhalten.
Anmerkung: Eine 10-fache Verdünnung ergibt nicht für alle Bakterienarten 4 x 106 KBE ml-1, berechnen Sie den erforderlichen Verdünnungsfaktor, indem Sie serielle Verdünnungen zwischen 1 x 10-1-1 x 10-6 verteilen.
- Gießen Sie die verdünnte Kultur in eine sterile Plastikflasche für einen Parfümverdampfer.
Anmerkung: Das Gesamtvolumen muss größer sein, als für die Anzahl der zu besprühenden Agarplatten erforderlich ist. Ca. 250 μl pro Platte sind für eine Petrischale mit einem Durchmesser von 9 cm geeignet.
>7. Assay zur verzögerten Wachstumshemmung
- Sprühen Sie die Kultur durch jede der Verdampferflaschen, um sicherzustellen, dass die Kultur in den Sprühmechanismus geladen wird, bevor sie auf den Agar gesprüht wird.
- Aus einem Abstand von ca. 15 cm über dem Agar werden ca. 250 μl verdünnte Kultur (3 Sprühstöße eines typischen 50-ml-Verdampfers) über die gesamte Agaroberfläche gesprüht. Inkubieren Sie die Agarplatten bei 37 °C aerob über Nacht. Wiederholen Sie den Vorgang für andere Platten mit der gleichen Anzahl von Sprühstößen.
>8. Interpretation der Ergebnisse von Assays zur verzögerten Wachstumshemmung
- Messen Sie die Wachstumshemmungszone des besprühten Konkurrenzstamms (Abbildung 1A-C, "X" bis "X") in Millimetern und subtrahieren Sie den Durchmesser des zentralen Spots des Inhibitor-Produzenten (Abbildung 1A-C, "Y" bis "Y").
HINWEIS: Abbildung 1E zeigt, wie diese Daten dargestellt werden könnten
- Notieren Sie den Klarheitswert für Hemmzonen.
Anmerkung: Dies zeigt den Grad der beobachteten Hemmung an. Beispiele sind in Abbildung 1A-D dargestellt, Dehnungen, die zur Standardisierung verwendet werden können, werden im Abschnitt "Repräsentative Ergebnisse" vorgeschlagen. Die folgende Skala kann für die Reinheitsbewertung verwendet werden: ein Klarheitswert von 0, um eine Zone zu beschreiben, in der das Wachstum des Konkurrenzstamms vollständig gehemmt ist. Ein Wert von 1 beschreibt eine Zone mit fast vollständiger Hemmung des Wachstums, wobei nur einzelne Kolonien in der Lichtungszone vorhanden sind. Ein Wert von 2 beschreibt eine sichtbare Zone mit reduziertem Wachstum, das Wachstum innerhalb dieser Zone ist konfluent oder nahe dem Konfluent, aber in der Dichte um >50 % reduziert. Ein Score von 3 beschreibt nur eine minimale Wachstumsreduktion, das Wachstum ist konfluent und um weniger als 50 % reduziert, und eine Zone ist immer noch sichtbar und messbar. Ein Score von 4 beschreibt keine sichtbare Hemmung des Wachstums. Ein Score von 5 beschreibt, dass das Wachstum des Konkurrenzstammes in der Nähe des Testinhibitor-produzierenden Stammes erhöht war. Beispiele finden Sie in Abbildung 1. Diese Werte sind für den Experimentator subjektiv.
