Ein Assay zur Quantifizierung von zytosolischen und vakuolären Salmonellen in infizierten primären Makrophagen

Zusammenfassung

Quelle: Meunier, E., et al. Quantifizierung von zytosolischen vs. vakuolären Salmonellen in primären Makrophagen durch differentielle Permeabilisierung. J. Vis. Exp. (2015).

Dieses Video zeigt einen Assay zur Quantifizierung von zytosolischem und vakuolärem Salmonella typhimurium in aus dem Knochenmark stammenden Makrophagen mittels differentieller Permeabilisierung. Die Makrophagen sind mit einer fluoreszierenden Protein-exprimierenden Salmonelle infiziert, die in einer spezialisierten Vakuolenstruktur namens Salmonellen-haltige Vakuole oder SCV internalisiert ist. Eine Untergruppe von Bakterien entkommt dem SCV und dringt in das Zytosol ein. Die cholesterinreiche Plasmamembran von Makrophagen wird mit Digitonin permeabilisiert, wobei das SCV intakt bleibt. Nach der Markierung der zytosolischen Bakterien mit einem fluoreszenzmarkierten Antikörper wird der prozentuale Anteil der vakuolären und zytosolischen Bakterien mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) quantifiziert.

Protokoll

>1. Digitonin-Assay mit mCherry-exprimierenden Salmonellen (FACS-basierte Analyse)

1. Aufbereitung von Bakterien
   Hinweis: In diesem Assay wird Salmonella-Wildtyp SL1344 (Streptomycin-resistent), der mCherry aus einem Plasmid exprimiert (pFPV, das für mCherry unter dem rpsM-Promotor kodiert) exprimiert. Die bakterielle Phagozytose und Proliferation wurde durch die konstitutive Expression von mCherry nicht verändert (Daten nicht gezeigt).
   1. Inokulieren Sie den Stamm 1 Tag vor der Infektion in 3 ml LB-Medium, das mit Streptomycin (90 μg/ml) und Ampicillin (100 μg/ml, mCherry-exprimierender Vektor) in einem Shaker bei 37 °C O/N ergänzt wurde.
2. Plattierung von Zellen gegen Infektionen.
   1. Wildtyp-BMDMs in einer 24-Well-Platte mit einer Dichte von 1,25 x 10⁵ Zellen/Well in 1 ml primärem Makrophagenmedium (DMEM, ergänzt mit 10 % fetalem Kälberserum (FCS, hitzeinaktiviert, 56 °C, 30 min), 1 % 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethensulfonsäure (HEPES), 1 % nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA), 1 % L-Glutamin und 10 % L929-Überstand (konditioniertes Medium aus Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor (M-CSF), das L929-Zellen produziert). Saatgutvertiefungen gemäß Tabelle 1 berücksichtigen die einzelnen Bedingungen. Fügen Sie Deckgläser zu den Vertiefungen hinzu, die als Kontrollen verwendet werden (Tabelle 1).
   2. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht in einem Inkubator bei 37 °C und 5 % CO₂.
3. Vorbereitung der Bakterien auf eine Infektion.
   1. Bestimmen Sie am nächsten Tag die Konzentration von Salmonellen in der Übernachtkultur, indem Sie die Kultur 1:10 in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) verdünnen und den OD₆₀₀ gegen eine reine PBS-Kontrolle messen. Dadurch wird sichergestellt, dass der OD₆₀₀ im linearen Bereich des Spektralphotometers gemessen wird.
   2. Berechnen Sie die Konzentration von Salmonellen pro ml. Ein OD₆₀₀ von 1 entspricht 1 x 10⁹ Bakterien.
   3. Verdünnen Sie die Bakterien in einem Makrophagenmedium auf eine Salmonellenkonzentration von 1,25 x 10⁶ Zellen/ml.
4. Infektion von Zellen mit Salmonellen.
   1. Entfernen Sie das Medium aus den BMDMs. Geben Sie 1 ml Makrophagenmedium in nicht infizierte Kontrollvertiefungen (B1-B3, C1-C3). 1 ml Salmonellensuspension in die Vertiefungen A1 - A5 geben, um eine Multiplizität der Infektion (m.o.i.) von 10 Bakterien pro Zelle zu erreichen.
   2. Zentrifugieren Sie die Platte 15 min lang bei 300 x g bei 37 °C, um die Infektion zu synchronisieren. Die Platte bei 37 °C und 5 % CO₂ in einen Inkubator umstellen.
5. Abtötung extrazellulärer Salmonellen mit Gentamicin.
   1. 1 Stunde nach der Infektion nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator und fügen Sie 0,1 ml Makrophagenmedium mit 0,1 mg/ml Gentamicin hinzu, um extrazelluläre Bakterien abzutöten. Geben Sie Gentamicin in alle Vertiefungen, auch in nicht infizierte Kontrollen, um sicherzustellen, dass alle Zellen auf die gleiche Weise behandelt werden. Die Platte bei 37 °C und 5 % CO₂ in einen Inkubator umstellen.
6. Waschen der Zellen.
   1. 2 Stunden nach der Infektion nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator und waschen Sie alle Vertiefungen 2x mit 1 ml einfachem DMEM (vorgewärmt auf 37 °C) und ersetzen Sie es durch Makrophagenmedium (vorgewärmt auf 37 °C) mit 10 μg/ml Gentamycin, um das Wachstum verbleibender extrazellulärer Bakterien zu verhindern. Die Platte bei 37 °C und 5 % CO₂ in einen Inkubator umstellen.
7. Vorbereitung frischer Puffer mit Detergenzien und Antikörpern.
   1. Kurz vor dem gewünschten Analysezeitpunkt bereiten Sie eine frische Stammlösung von Digitonin mit 1 mg/ml in KHM-Puffer (110 mM Kaliumacetat, 20 mM HEPES, 2 mM MgCl₂, pH 7,3) vor. Filtrieren Sie das Material und verdünnen Sie es in KHM-Puffer auf eine Arbeitskonzentration von 50 μg/ml Digitonin. Bereiten Sie außerdem eine Lösung von 0,1 % Saponin in KHM-Puffer, Anti-Salmonellen-Antikörper, gekoppelt an Fluorescein-Isothiocyanat (CSA-1-FITC) bei 1/500, Anti-Calnexin bei 1/100 oder Anti-Proteindisulfid-Isomerase (Anti-PDI) bei 1/100 in KHM-Puffer vor, ergänzt mit 3 % Rinderserumalbumin (BSA).
8. Permeabilisierung der Zellen.
   1. Nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator und spülen Sie die Vertiefungen 3x mit 0,5 ml KHM Puffer (auf 37 °C vorgewärmt). Entfernen Sie den KHM-Puffer und geben Sie 0,25 ml reinen KHM-Puffer in die Vertiefungen A4 und B1/C1, KHM-Puffer mit Digitonin in die Vertiefungen A1 - A3 und B2/C2 oder KHM-Puffer mit Saponin in die Vertiefungen A5 und B3/C3 (gemäß Tabelle 1). Exakt 1 min bei RT inkubieren und alle Wells sofort 3x mit 0,5 ml KHM Buffer waschen (auf 37 °C vorgewärmt).
9. Färbung von primären Antikörpern.
   1. Entfernen Sie den KHM-Puffer und geben Sie die primären Antikörperlösungen (Ziegen-Anti-Salmonellen-FITC, 250 μl/Well, 0,1 μg/ml) in die entsprechenden Wells (Abbildung 1, Tabelle 1). Inkubieren Sie die Platte 15 min lang in einem Inkubator bei 37 °C und 5 % CO₂
   .
   2. Waschen Sie die Zellen 1x mit 1 mL PBS.
10. Infizierte Zellen (Vertiefungen A1 - A5): FACS-Analyse
    1. Waschen Sie die Zellen 3x mit PBS und fügen Sie 0,5 mL eiskaltes PBS mit 0,1% Triton hinzu. In ein 5-ml-FACS-Röhrchen mit einer Zellsiebkappe umfüllen, um die Zellaggregate aufzubrechen. Bewahren Sie die Proben auf Eis auf.
    2. Analysieren Sie die Proben von FACS. Stellen Sie mit den vollständig permeabilisierten Reglern zuerst das Gate für die Gesamtzahl der Bakterien basierend auf Vorwärts- und Seitenstreuung (FSC/SSC) und das mCherry-Signal (610 nm ± 20 nm Filter) ein.
    3. Als nächstes analysieren Sie das FITC-Signal in der gesamten Bakterienpopulation unter Verwendung der vollständig permeabilisierten und nicht permeabilisierten Kontrollen, um die Gates für zytosolische Bakterien (FITC+, mCherry+) und vakuoläre Bakterien (FITC-, mCherry+) festzulegen (Abbildung 2).
    4. Wenn die Gates gesetzt sind, analysieren Sie die Proben und bestimmen Sie den Prozentsatz an zytosolischen vs. vakuolären Bakterien mit der FlowJo-Software gemäß dem Protokoll des Herstellers.

Tabelle 1: Beschichtungsschema für aus Knochenmark gewonnene Makrophagen (BMDMs) in einem 24-Well-Format für die nachfolgende Infektion mit Salmonellen, Permeabilisierung und Färbung.

		Permeabilisierung		Färben
	Glas-Deckglas	Salmonelle	Digitonin	saponin	Anti-Salmonellen	Anti-Calnexin	Anti-PDI
A1 (Probe)	-/+*	+	+		+
A2 (Muster)	-/+*	+	+		+
A3 (Muster)	-/+*	+	+		+
A4 (keine Permeabilisierungskontrolle)	-/+*	+			+
A5 (vollständige Permeabilisierungskontrolle)	-/+*	+		+	+
B1 (gefärbt für Calnexin)	+					+
B2 (gefärbt für Calnexin)	+		+			+
B3 (gefärbt für Calnexin)	+			+		+
C1 (für PDI gebeizt)	+						+
C2 (für PDI gebeizt)	+		+				+
C3 (für PDI gebeizt)	+			+			+

Ergebnisse

Abbildung 1. Schematische Darstellung des Protokolls 1. Infizierte Zellen, die mCherry-positive Salmonellen entweder in intakten Vakuolen oder im Zytosol enthalten, werden differentiell mit Digitonin permeabilisiert. Zytosolische Salmonellen werden mit Anti-Salmonellen gefärbt, die an FITC gekoppelt sind. Die Zellen werden mit dem Triton X-100 für die FACS-Analyse gewasc...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Digitonin	Sigma	Nr. D5628	50ug/ml
PFA	MPBIO (Englisch)	219998380
HEPES	Lebenstechnologien	Artikel-Nr.: 15630
Kaliumacetat	Sigma	791733
MgCl2	Sigma	M8266
Bsa	Sigma	Nr. A2153
Anti-Salmonellen CSA-1-FITC	KPL	01-91-99-MG	1/500
Anti-Salmonellen CSA-1	KPL	02-91-99-MG	1/500
Anti-Calnexin	Enzo Biowissenschaften	SPA-860D	1/100
Anti-PDI	Enzo Biowissenschaften	SPA-890	1/100
saponin	Sigma	Artikel-Nr.: 47036
Vectashield Eindeckmedium	Vectorlabs	H-1200
Anti-Kaninchen-Antikörper-488	Molekulare Sonden	Nr. A-11070	1/500
gentamicin	Lebenstechnologien	Nr. 15710-49	100ug/mL und 10ug/mL
Triton X-100	Promega	Nr. H5141
Pbs	Gibco	20012-019
DMEM	Sigma	Nr. D6429
NEAA	Amimed	5-13K00-H
FACS Fortessa	BD-Technologien		Detektion mCherry 610 nm
FACS Fortessa	BD-Technologien		Detektion FITC 530 nm

Blatt Blatt kg kg Blatt