Alle Eingriffe mit menschlichen Teilnehmern wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für das Wohlergehen des Menschen durchgeführt und vom lokalen institutionellen Prüfungsausschuss überprüft.
1. Puffervorbereitung für die Entnahme von menschlichem Blut und die Isolierung gewaschener Blutplättchen
- Bereiten Sie eine wässrige Lösung von 100 ml Sauer-Citrat-Dextrose (ACD) her, indem Sie 1,4 g Zitronensäuremonohydrat (C6H8O7•H2O, 66,6 mM), 2,5 g Trinatriumcitrat-Dihydrat (Na3C6H5O7•2 H2O, 85 mM) und 2 g wasserfreie D(+)-Glucose auflösen. Der pH-Wert der Lösung liegt bei etwa 4,5.
- Bereiten Sie Stammlösungen für den Tyrode-Puffer wie folgt vor
- Bereiten Sie Stammlösung 1 vor, indem Sie 80 g Natriumchlorid (NaCl), 2 g Kaliumchlorid (KCl), 10 g Natriumbicarbonat (NaHCO3) und 0,58 g Natriumdihydrogenphosphat-Monohydrat (NaH2PO4*H2O) in 500 ml destilliertem H2O lösen. Die jeweiligen Endkonzentrationen betragen 2,73 M, 53,6 mM, 238 mM und 8,4 mM. Halten Sie die Lösung bei 4 °C.
- Die Stammlösung 2 wird durch Auflösen von 10,15 g Magnesiumdichloridhexahydrat (MgCl2*6 H2O) (100 mM) in 500 mL destilliertem Wasser (H2O) hergestellt. Halten Sie die Lösung bei 4 °C.
- Die Stammlösung 3 wird durch Auflösen von 10,95 g (100 mM) Calciumchloridhexahydrat CaCl2*6 H2O in 500 mL destilliertem H2O hergestellt. Die Lösung wird bei 4 °C gehalten.
- Der Tyrode-Puffer wird durch Verdünnung von 2,5 ml Stammlösung 1 in einem Endvolumen von 50 ml mit destilliertem H2O hergestellt. Dies entspricht Endkonzentrationen von 136,5 mM NaCl, 2,68 mM KCl, 11,9 mM NaHCO3 und 0,42 mM NaH2PO4*H2O. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,35 ein und sterilisieren Sie durch Filtrieren mit 0,22-μm-Filtern.
- Bereiten Sie Tyrodes Albumin-Puffer 0,35 % (TA-Puffer) vor, indem Sie 5 mL Stammlösung 1, 1 mL Stammlösung 2, 2 mL Stammlösung 3, 0,5 mL 1M HEPES, 1,8 mL 200 g/L Humanserumalbumin und 0,1 g wasserfreie D(+)-Glucose in einem Endvolumen von 100 mL destilliertem H2O verdünnen.
- Stellen Sie den pH-Wert mit 1N Salzsäure (HCl) auf 7,35 ein und stellen Sie die Osmolarität auf 295 mOsm/L ein, indem Sie destilliertes H2O (10 % des Gesamtvolumens) hinzufügen. Die Endkonzentrationen in dieser Lösung betragen 124 mM NaCl, 2,44 mM KCl, 10,82 mM NaHCO3, 0,38 mM NaH2PO4*H2O, 0,91 mM MgCl2*6 H2O, 1,82 mM CaCl2*6 H2O. Halten Sie den TA-Puffer während des gesamten Experiments bei 37 °C.
>2. Blutentnahme
- Sammeln Sie 45-50 ml venöses Blut aus der Antekubitalvene mit einer 19-g-Nadel und ohne oder mit niedrigem Tourniquet in 50 ml-Röhrchen, die das ACD-Antikoagulans enthalten (1 Volumen ACD für 6 Volumina Blut). Entsorgen Sie die ersten 1-2 ml Blut, um das Vorhandensein von Thrombin und Gewebefaktor zu vermeiden.
- Mischen Sie nach der Entnahme das Blut mit dem ACD, indem Sie das Röhrchen vorsichtig umdrehen. Inkubieren Sie die Probe 10 Minuten lang bei 37 °C.
3. Präparation von menschlichen gewaschenen Blutplättchen
- Heizen Sie die Zentrifuge auf 37 °C vor. Alle unten aufgeführten Zentrifugationsschritte werden bei dieser Temperatur durchgeführt.
- Das gesammelte Blut wird in 15-ml-Röhrchen (5 mL pro Röhrchen) abgefüllt und 13 Minuten lang bei 250 x g zentrifugiert, um plättchenreiches Plasma, PRP, zu erhalten.
Anmerkung: Dieser Zentrifugationsschritt führt zur Herstellung von drei Schichten in der Probe: 1) Die obere Schicht, bestehend aus Plasma, Blutplättchen und einem kleinen Teil der weißen Blutkörperchen. 2) Die Zwischenschicht, ein Teil, der reich an weißen Blutkörperchen ist. 3) Die untere Schicht, die im Wesentlichen aus roten Blutkörperchen besteht.
- Sammeln Sie das PRP, indem Sie die obere Schicht vorsichtig in ein neues 15-ml-Röhrchen pipettieren, um eine Kontamination mit roten und weißen Blutkörperchen maximal zu verhindern, und inkubieren Sie es 10 Minuten lang bei 37 °C.
- Zentrifugieren Sie das PRP bei 2.200 x g für 12 min (für 5 mL PRP).
Anmerkung: Dieser Zentrifugationsschritt sollte mit niedriger Bremse oder ohne Bremse durchgeführt werden.
- Entfernen Sie den Überstand (plättchenarmes Plasma) und resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig mit 10 ml TA-Puffer mit 2 μl/ml Heparin (5.000 U/ml) und 2,5 μl/ml 25 μM Prostacyclin (PGI2) mit einer Pasteurpipette aus Kunststoff. 10 min bei 37 °C inkubieren.
- 2,5 μl/ml 25 μM Prostacyclin-I2 (PGI2) zugeben und 8 min bei 1.900 x g zentrifugieren (mit niedriger Bremse oder ohne Bremse).
- Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet mit 5 mL TA-Puffer mit 2,5 μl/ml 25 μM PGI2 unter Verwendung einer Pasteurpipette aus Kunststoff. 10 min bei 37 °C inkubieren.
- Während der Inkubationszeit pipettieren Sie 150 μl der Thrombozytensuspension in ein 1,5-ml-Röhrchen und zählen Sie die Blutplättchen mit einem automatisierten Zellzähler (der die Größe der Blutzellen durch Messung der Änderungen des Gleichstromwiderstands ermittelt).
- Nach der 10-minütigen Inkubation geben Sie 2,5 μl/ml 25 μM PGI2 in die Thrombozytensuspension und zentrifugieren Sie sofort bei 1.900 x g für 8 Minuten.
- Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet auf eine Konzentration von 250.000 Thrombozyten/μl mit einem ausreichenden Volumen TA-Puffer (d. h. wenn die Zellzahl 500.000 pro μl beträgt, resuspendieren Sie in 10 mL TA-Puffer), der 32 μl/ml Apyrase bei 0,01 U/ml (Endkonzentration 0,32 U/ml) enthält.
Anmerkung: Eine hohe Konzentration an Apyrase wird verwendet, um die Desensibilisierung von P2X-Purinozeptor 1, P2X1-Rezeptoren zu vermeiden, die durch spontane Sekretion von Adenosintriphosphat (ATP) in Abwesenheit von Agonisten induziert wird. Dies ist wichtig, da kollageninduzierte Reaktionen durch eine schnelle parakrine/autokrine Aktivierung von P2X1 durch ATP induziert werden, das von aktivierten Blutplättchen freigesetzt wird. Wenn der Thrombozytensignalweg die Aufrechterhaltung der P2X1-Funktion nicht kritisch erfordert, verwenden Sie 0,02 U/ml Apyrase. Mehrere Studien zeigten, dass 0,02 U/ml-Apyrase den Adenosindiphosphat-ADP-Rezeptor P2Y, den Purinoceptor 1 und die P2Y1-Desensibilisierung mit vernachlässigbaren P2X1-Reaktionen vermeidet.
- Inkubieren Sie die Zellsuspension mindestens 30 Minuten lang bei 37 °C, bevor Sie die aggregometrischen Messungen durchführen. Das Präparat ist 5 bis 8 Stunden haltbar.
>4. Aggregometrie
- Bereiten Sie Fibrinogen (56 mg/ml) in Tyrode-Puffer vor.
- Pipettieren Sie 260 μl Thrombozytensuspension in Glasküvetten (Abbildung 1A; linke Küvette), die 10 μl Fibrinogen (56 mg/ml) und einen magnetischen Rührstab enthalten, und inkubieren Sie die Suspension dann für 2 - 3 min bei 37 °C in Inkubationsvertiefungen, die im Aggregometer vorhanden sind (Abbildung 1B und 1C).
- Vorinkubieren Sie mit dem Panx1-Inhibitor Brilliant Blue FCF durch Zugabe von 10 μl einer 2,8 mM oder 28 mM Stammlösung (Endkonzentration 100 μM bzw. 1 mM) für 7 min bei 37 °C.
- Kalibrieren Sie das Aggregometer auf einen angenommenen Aggregationswert von 100 %, indem Sie die optische Dichte (OD) einer Küvette messen, die 10 μl Fibrinogen (56 mg/ml), 10 μl Brilliant Blue FCF (2,8 mM oder 28 mM) und TA-Puffer ohne Blutplättchen enthält.
- Stellen Sie die Küvette in eine Aggregationsvertiefung unter automatischem Rühren und drücken Sie die entsprechende Taste auf der Tastatur des Computers, der mit dem Aggregometer verbunden ist (d. h. drücken Sie F1, wenn die Aggregationsvertiefung 1 verwendet wird).
Anmerkung: Dieses im Folgenden beschriebene Experiment beinhaltet Brilliant Blue FCF. Die für die Kalibrierung verwendete Verbindung muss an die Versuchsbedingungen angepasst werden.
- Kalibrieren Sie das Aggregometer auf einen angenommenen Aggregationswert von 0 %, indem Sie dieselbe Thrombozytenprobe verwenden, die für das Experiment unter automatischem Rühren verwendet wird.
- Legen Sie die Küvette in die Aggregationsvertiefung und drücken Sie die entsprechende Taste auf der Tastatur des Computers, der mit dem Aggregometer verbunden ist. Warten Sie ca. 20-30 s, bevor Sie fortfahren. Diese Verzögerung dient dazu, sicherzustellen, dass keine Aggregation stattfindet, bevor die Agonisten hinzugefügt werden.
Anmerkung: Da sich jeder Unterschied in der Thrombozytenzahl auf die gemessene OD auswirken kann, muss der Kalibrierungsschritt von 0 % für jede einzelne Messung wiederholt werden.
- Geben Sie 20 μl des gewünschten Agonisten, z. B. 15 μg/ml Kollagen (1 μg/ml endgültig) oder 1,125 mM Arachidonsäure (75 μM endgültig), in die Küvette. Starten Sie die Aufnahme sofort unter kontinuierlichem automatischem Rühren, indem Sie die entsprechende Taste auf der Tastatur des Computers drücken, der mit dem Aggregometer verbunden ist.
Anmerkung: Die Zugabe des Agonisten induziert die Thrombozytenaktivierung. Thrombozytenaggregate sind in der Glasküvette am Ende des Versuchs deutlich zu unterscheiden (Abbildung 1A; rechte Küvette).
- Die Aufnahme stoppt automatisch nach 6 min. Speichern Sie an dieser Stelle die Daten, indem Sie auf dem Computer auf das Speichern-Symbol klicken.
Anmerkung: Die Berechnung der Aggregationsrate erfolgt durch den Computer, der die Endergebnisse des Aggregationsprozesses in Prozent ausdrückt.
