HINWEIS: Alle in den Abschnitten 1 und 2 beschriebenen Schritte werden unter sterilen Bedingungen in einem Laminar-Flow-Schrank durchgeführt.
>1. Wartung von U87. CD4.hCXCR4-Zellen
- Die Zellen werden in T75-Kulturflaschen bei 37 °C und 5 % CO2 in einem befeuchteten Inkubator gezüchtet.
Anmerkung: Die in vitro Zelllinie, die in diesem Protokoll verwendet wird, ist eine U87-Glioblastom-Zelllinie, die stabil den Differenzierungscluster 4 (CD4) und den humanen CXC-Chemokinrezeptor 4 (CXCR4) exprimiert und zuvor beschrieben wurde. Die Zelloberflächenexpression von CD4 und CXCR4 wird kontinuierlich durch Durchflusszytometrie überwacht und die Expressionsniveaus bleiben über die Zeit konstant (~ 100% CD4+ und ~ 100% CXCR4+ Zellen). Eine detaillierte Beschreibung der Erzeugung der verwendeten Zelllinie und des durchflusszytometrischen Verfahrens zur Untersuchung der Rezeptorexpressionsniveaus liegt nicht im Rahmen dieses Protokolls.
- Subkulturzellen mit 80-85% Konfluenz. Lassen Sie alle Reagenzien vor der Zellkultivierung Raumtemperatur (RT) erreichen.
- Entfernen Sie das konditionierte Kulturmedium von den Zellen und waschen Sie die Zellmonoschicht einmal mit 5 mL phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
- Fügen Sie 3 ml 0,25% Trypsin-Ethylendiamin-Tetraessigsäure (Trypsin-EDTA) hinzu und verteilen Sie sie gleichmäßig über die Zellmonoschicht. Entfernen Sie dann das überschüssige Trypsin-EDTA und inkubieren Sie es bis zu 5 Minuten bei 37 °C, bis sich die Zellen abzulösen beginnen.
- Fügen Sie 10 ml frisches, vollständiges Wachstumsmedium hinzu (Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) + 10 % fötales Rinderserum (FBS) + 0,01 M 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethensulfonsäure (HEPES) + geeignete Selektionsmittel). Resuspendieren Sie die Zellen, indem Sie sie vorsichtig auf und ab pipettieren. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein steriles 50-ml-Röhrchen.
- Zählen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen mit einer Methode Ihrer Wahl. Im Falle von U87-Glioblastomzellen erreicht die Lebensfähigkeit in der Regel ~ 100%.
Anmerkung: Die Zellzahl kann auf verschiedene Arten bestimmt werden. Wir verwenden routinemäßig ein automatisiertes Zellanalysesystem, das auf der Trypanblau-Färbung basiert (siehe Materialtabelle) gemäß den Standardhandhabungsverfahren, aber andere Methoden sollten genauso gut funktionieren.
- 2 x 10,6 oder 3 x 106 (lebensfähige) Zellen werden in einen T75-Kulturkolben mit einem Endvolumen von 25 ml frischem Wachstumsmedium gegeben und bei 37 ΰC und 5 % Kohlendioxid (CO2) inkubiert.
Anmerkung: Wenn 3 x 106 Zellen verwendet werden, erreichen die Zellen nach 2 Tagen eine Konfluenz von 80-90%. Wenn 2 x 106 Zellen verwendet werden, erreichen sie nach 3 Tagen die gleiche Konfluenz. Die Wachstumsrate der Zellen sollte zunächst empirisch bestimmt werden, wenn andere Zelllinien verwendet werden.
>2. Aussaat der Zellen für den Ca2+ Mobilisierungsassay
- Am Tag der Zellpassage (Tag 0) beschichten Sie schwarz wandige Polystyrol-96-Well-Platten mit durchsichtigem Boden (siehe Materialtabelle) mit einer 0,1%igen Gelatinelösung, um die Zelladhäsion zu erleichtern.
Anmerkung: Die Beschichtung der 96-Well-Platten mit Gelatine kann entfallen, wenn vorbeschichtete Platten verwendet werden, die im Handel erhältlich sind (siehe Materialtabelle). Es wird empfohlen, die Verwendung von vorbeschichteten Platten anstelle einer manuellen Beschichtung für jede zu untersuchende Zelllinie zu bewerten, bevor mit dem Protokoll fortgefahren wird.
- Bereiten Sie eine Gelatinelösung vor, indem Sie 1 g Gelatine zu 100 ml PBS hinzufügen, um eine 1%ige Lösung zu erhalten. Vor der weiteren Verwendung mit PBS um das 10-fache verdünnen. Um die Löslichkeit von Gelatine zu verbessern, erhitzen Sie die Lösung auf 37 °C.
- Fügen Sie 100 μl 0,1%ige Gelatinelösung pro Vertiefung der 96-Well-Platte mit einer Mehrkanalpipette hinzu. 2 Stunden bei RT inkubieren.
- Bereiten Sie in der Zwischenzeit die Zellen in der beschichteten 96-Well-Platte für die Aussaat vor.
- Nehmen Sie die Zellen aus dem Kulturkolben, resuspendieren Sie sie in dem frischen Wachstumsmedium und zählen Sie sie mit der Trypanblau-Färbemethode.
- Schleudern Sie die Zellen in einem 50-ml-Röhrchen für 5 Minuten bei 400 x g bei RT.
- Resuspendieren Sie die Zellen in einem frischen Wachstumsmedium (DMEM + 10 % FBS + 1 % HEPES, keine Antibiotika), um eine Zelldichte von 0,1 x 106 (lebensfähigen) Zellen/ml zu erhalten.
- Entferne die Gelatinelösung von den schwarzwandigen Platten mit durchsichtigem Boden, indem du die Platte umdrehst und auf einem Taschentuch trocknest. Fügen Sie 200 μl/Vertiefung PBS hinzu, um überschüssige Gelatine zu entfernen, und drehen Sie die Platte erneut um.
- Dispensieren Sie 200 μL der Zellsuspension (entsprechend 0,2 x 105 Zellen) pro Well in die gelatinebeschichtete 96-Well-Platte (von nun an wird diese Platte im Folgenden als "Messplatte" bezeichnet).
- Die Platte über Nacht bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid (CO2) inkubieren.
>3. Beladung der Zellen mit einem fluoreszierenden Ca2+ -empfindlichen Farbstoff
- An Tag 1 wird der eigentliche Ca2+-Mobilisierungsassay durchgeführt, beginnend mit der Beladung der ausgesäten Zellen mit dem fluoreszierenden Ca2+-bindenden Farbstoff Fluo-2-Acetoxymethyl (Fluo-2 AM).
- Bereiten Sie den Assay-Puffer vor, indem Sie 40 ml HEPES (1 m) zu 200 ml Hank's Balanced Salt Solution (HBSS, 10x, kein Phenolrot, kein Natriumbicarbonat) hinzufügen. Reinstwasser zugeben, um ein Endvolumen von 2 l zu erhalten, und 4 g Rinderserumalbumin (BSA) zugeben. Lösen Sie das BSA durch magnetisches Rühren auf. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 (mit Natriumhydroxid, NaOH) ein und filtrieren Sie die Lösung.
Anmerkung: Bei allen folgenden Schritten wird derselbe Puffer, der als "Assay-Puffer" bezeichnet wird, verwendet.
- Bereiten Sie eine Stammlösung (4 mM in Dimethylsulfoxid (DMSO)) des fluoreszierenden Ca2+-empfindlichen Farbstoffs fluo-2 AM vor. Vermeiden Sie übermäßige Lichteinwirkung. 1 mg Fluo-2 AM (Molekulargewicht: 1.061 g/mol) in 235,6 μl DMSO auflösen.
- Bereiten Sie eine Arbeitslösung von fluo-2 AM vor. Für eine 96-Well-Assay-Platte werden 12,5 μl Fluo-2 AM-Stammlösung (4 mM) und 12,5 μl nichtionische Tensid-Polyol-Lösung (z. B. pluronic f-127) (20 % Gew./Volumen in DMSO, siehe Materialtabelle) gemischt. Geben Sie 22 μl dieser Mischung in einen 11-ml-Assay-Puffer in einem 15-ml-Röhrchen. Die Endkonzentration von Fluo-2 AM beträgt 4 μM.
Anmerkung: Das nichtionische Tensid wird als Dispersionsmittel verwendet, um die wässrige Löslichkeit von Fluo-2 AM zu verbessern und damit die Zellbeladung zu erhöhen. Um das Tensid in DMSO zu lösen, erhitzen Sie die Probe auf 37 °C und mischen Sie sie regelmäßig, um eine homogene Lösung zu erhalten.
- Entfernen Sie das Wachstumsmedium von den zuvor ausgesäten Zellen in der 96-Well-Messplatte, indem Sie die Platte umdrehen und auf einem Papiertuch trocknen.
- Geben Sie mit einer Mehrkanalpipette 100 μl Ladefarbstofflösung pro Vertiefung hinzu und inkubieren Sie 45 Minuten lang bei RT im Dunkeln.
>4. Herstellung von 96-Well-Polypropylenplatten, die den Chemokin-Liganden CXC, den Chemokin-Liganden 12 (CXCL12) oder die zu untersuchenden Verbindungen enthalten
- Besorgen Sie sich 96-Well-Platten aus Polypropylen (PP) mit rundem Boden (siehe Materialtabelle).
- Die Stammlösung von CXCL12 (1 mg/ml) und die Stammlösung der untersuchten Verbindungen bei RT äquilibrieren lassen.
Anmerkung: Die Stammlösung von CXCL12 wird in Reinstwasser hergestellt, mit 0,01 % Tween20 versetzt und bei -20 °C als Einmal-Aliquote gelagert.
- Bereiten Sie eine 5-fach konzentrierte Lösung von CXCL12 in Assay-Puffer (250 ng/ml, was 31,25 nM entspricht) und eine 5-fache konzentrierte Verdünnung jeder Verbindung (in Assay-Puffer) vor.
- Geben Sie die Stammlösungen gemäß einem vordefinierten Plattenlayout in die entsprechende 96-Well-Platte. Geben Sie 75 μl/Vertiefung in die Platte, die CXCL12 enthält (die "Chemokinplatte"), und geben Sie 50 μl/Vertiefung in die Platte, die die Verbindungen enthält (die "Verbundplatte").
Anmerkung: Beide Verbindungen und CXCL12 werden schließlich beim Dispensieren in der Messplatte 5x verdünnt. Es ist auch wichtig, Negativkontrollvertiefungen, die nur Assay-Puffer enthalten, sowohl in die Verbindungsplatte als auch in die Chemokinplatte aufzunehmen. Außerdem müssen Positivkontroll-Wells einbezogen werden (d. h. Wells mit CXCL12 in der Chemokinplatte, aber mit Assay-Puffer in den entsprechenden Wells der Verbundplatte).
>5. Protokolleinstellungen auf dem Fluoreszenz-Mikroplatten-Reader
HINWEIS: Der in diesem Protokoll verwendete Fluoreszenz-Mikroplatten-Reader wird in der Materialtabelle angegeben.
- Schalten Sie zuerst die Kühleinheit des Fluoreszenzplatten-Readers ein und dann den Fluoreszenz-Reader selbst. Lassen Sie den Vorgang einige Minuten lang starten und öffnen Sie die Software des Systems.
- Erstellen Sie das Protokoll des Assays mithilfe des Drag-and-Drop-Menüs, das die folgenden Schritte enthält:
- Wählen Sie im Feld "Einstellungen" die Option "Read_Mode" mit einer Anregungswellenlänge: 470-495 nM und einer Emissionswellenlänge: 515-575 nM.
Anmerkung: Die gewählten Wellenlängen sind für die Verwendung mit dem Ca2+-empfindlichen Farbstoff fluo2 geeignet.
- Fügen Sie die Box "Mix with TF" (Transferflüssigkeit) für das automatische Mischen der Verbindungen in die Compound-Platte ein, die an den 2 Positionen des Geräts an der Quelle platziert wird (siehe Schritt 6.4). Wählen Sie 15 μl Lösung in jeder Vertiefung aus, die automatisch abgesaugt und dreimal gemischt werden soll. Stellen Sie die Höhe der Pipettenspitzen auf 20 μl unter der Flüssigkeitsoberfläche ein. Stellen Sie die Geschwindigkeit der Aspiration und Dosierung auf 50 μl/s ein.
Anmerkung: Die Höhe der Pipettenspitzen bezieht sich auf das Volumen, das unter den Pipettenspitzen verbleibt. Wenn die Vertiefungen einer Verbundplatte beispielsweise 50 μl enthalten, entspricht eine Höhe von 30 μl 20 μl unter der Flüssigkeitsoberfläche. Das Volumen der zum Mischen entnommenen Verbundlösung, die Geschwindigkeit des Mischens, die Position der Pipettenspitzen während des Mischens und die Anzahl der Mischzyklen können mit der Software eingestellt werden.
- Legen Sie im Feld "Transfer Fluid" fest, dass 20 μl jeder Vertiefung aus der Verbundplatte in die Messplatte übertragen werden. Positionieren Sie die Pipettenspitzen 20 μL unter der Flüssigkeitsoberfläche, d.h. in einer Höhe von 30 μL während der Aspiration der Compounds und in einer Höhe von 60 μL während des Dispensierens in der Messplatte. Stellen Sie die Aspirationsgeschwindigkeit auf 50 μl/s und die Dosiergeschwindigkeit auf 25 μl/s ein.
Anmerkung: Die Verbundplatte enthält 50 μL Lösung pro Vertiefung (siehe Schritt 4.1.3), somit entspricht eine Höhe von 30 μL einer Position 20 μL unter der Flüssigkeitsoberfläche. Die Messplatte enthält 80 μL Assay-Puffer pro Well (siehe Schritt 6.3), somit entspricht eine Höhe von 60 μL einer ähnlichen Position der Spitzen.
- Wählen Sie die Schaltfläche "Mit TF lesen". Während des ersten Intervalls werden 60 Messvorgänge (Fluoreszenzmessungen) mit einer Leseintervallzeit von 1 s ausgewählt. Legen Sie fest, dass 10 Messwerte aufgezeichnet werden, bevor die Verbindungen in die Messplatte dosiert werden, und danach 50 Messungen. Definieren Sie das zweite Intervall mit einer Leseintervallzeit von 30 Sekunden und 18 Lesevorgängen.
Anmerkung: Während dieses Schritts wird die Fluoreszenz kinetisch (in den definierten Zeitintervallen) für insgesamt ~ 10 min gemessen.
- Nehmen Sie die Schaltfläche "Waschtipps" dreimal in das Protokoll auf. Wählen Sie in jedem Waschschritt den Flüssigkeitstyp aus: Flüssigkeit A (Reinstwasser) oder Flüssigkeit B (70 % Ethanol), die Anzahl der Waschzyklen (1), die Pumpendrehzahl (Schnell) und die Anzahl der Hübe (5) während jedes Waschschritts.
Anmerkung: Während des ersten und letzten Waschschritts wird Flüssigkeit A verwendet, während des zweiten Waschschritts wird Flüssigkeit B verwendet.
- Fügen Sie die Funktion "Pipettor pausieren" hinzu. Stellen Sie die Pipette so ein, dass sie für 300 s.
Anmerkung: Durch die Aufnahme dieses Schritts in das Protokoll pausiert der Pipettierkopf, der in das Fluoreszenzplatten-Lesegerät integriert ist, für 5 Minuten, bevor er das Protokoll fortsetzt.
- Fügen Sie die Box "Mix with TF" hinzu, um das automatische Mischen der CXCL12-Lösung in der Chemokinplatte zu ermöglichen, die an der Position Quelle 3 des Geräts positioniert wird (siehe Schritt 6.4). Wählen Sie 15 μl Lösung in jeder Vertiefung aus, die automatisch abgesaugt und dreimal gemischt werden soll. Positionieren Sie die Pipettenspitzen während des Aspirierens und Mischens 20 μl unter der Flüssigkeitsoberfläche. Die Geschwindigkeit des Aspirierens und Dispensierens ist auf 50 μL/s eingestellt.
Anmerkung: Ähnlich wie in Schritt 5.2.2 können diese Parameter angepasst werden.
- Legen Sie im nachfolgenden Feld "Transfer Fluid" fest, dass 25 μl aus jeder Vertiefung der Chemokinplatte in die Messplatte übertragen werden. Positionieren Sie die Spitzen 20 μl unter der Flüssigkeitsoberfläche, d. h. in einer Höhe von 55 μl während der Aspiration von der Chemokinplatte, die 75 μl/Vertiefung enthält (siehe Schritt 4.1.3), und in einer Höhe von 80 μl während der Abgabe in die Messplatte. Stellen Sie die Aspirationsgeschwindigkeit auf 50 μL/s und die Dosiergeschwindigkeit auf 25 μL/s ein.
- Fügen Sie die Schaltfläche "Mit TF lesen" hinzu. Wählen Sie während des ersten Intervalls 145 Lesevorgänge mit einer Leseintervallzeit von 1 s aus. Legen Sie fest, dass 5 Messwerte aufgezeichnet werden, bevor CXCL12 in die Messplatte dosiert wird, und danach 140 Messwerte. Definieren Sie das zweite Intervall mit einer Leseintervallzeit von 6 s und wählen Sie 20 Lesevorgänge aus.
Anmerkung: Insgesamt werden im gesamten Protokoll 243 Messwerte (Fluoreszenzmessungen) aufgezeichnet: 78 in Schritt 5.2.4 und 165 in Schritt 5.2.9.
- Ähnlich wie bei Schritt 5.2.5 fügen Sie die Schaltfläche "Waschtipps" dreimal in das Protokoll ein.
Anmerkung: Wenn dieser Schritt am Ende des Protokolls eingefügt wird, können die Spitzen für die Durchführung eines weiteren Assays wiederverwendet werden, ohne dass die Spitzen gewechselt werden müssen.
- Stellen Sie die Temperatur des Geräts auf 37 °C ein, indem Sie auf die Schaltfläche "Bühnentemperatur einstellen" klicken und 37 °C auswählen.
>6. Ausführen des Fluoreszenzassays
- Nachdem die Messplatte 45 Minuten lang mit Ladepuffer inkubiert wurde (siehe Schritt 3.1.5), entfernen Sie den Puffer, indem Sie die Platte umdrehen und auf einem Taschentuch trocknen.
- Waschen Sie die ausgesäten Zellen durch Zugabe von 150 μl/Vertiefung Assay-Puffer und inkubieren Sie sie 2 Minuten lang.
- Entfernen Sie den Puffer wieder, indem Sie die Platte umdrehen. Geben Sie 80 μl/Vertiefung Assay-Puffer mit einer Mehrkanalpipette hinzu.
- Setzen Sie alle Platten an der entsprechenden Position in das Gerät ein: die Verbundplatte an der Position von Quelle 2, die Chemokinplatte an der Position von Quelle 3 und die Messplatte an der Leseposition. Stellen Sie eine Schachtel mit schwarzen Spitzen an die Position der Quelle 1 Spitzen. Schließen Sie die Tür des Geräts und inkubieren Sie es 5 Minuten lang, bevor Sie mit dem Protokoll fortfahren.
- Wählen Sie die Schaltfläche "Protokollsignaltest", um die Hintergrund-Relativlichteinheiten (RLUs) und die Fluoreszenzvarianz über der Platte zu bestimmen. Es öffnet sich ein neues Fenster. Wählen Sie "Signal testen".
Anmerkung: Während dieses Schritts werden Hintergrund-RLUs von der ICCD-Kamera (Intensified Charge-Coupled Device) bestimmt, die in den Optikraum des Fluoreszenz-Reader-Geräts integriert ist. Diese RLUs resultieren aus der Anregung desCa2+-empfindlichen Farbstoffs (Fluo-2) durch Leuchtdioden (LEDs) (LED-Ausgangswellenlänge 470-495 nm). Werte von 8.000-10.000 RLUs sind für diese Anwendung gut geeignet. RLUs können bei Bedarf durch Ändern der Anregungsintensität (Select Exc. Intensity) oder des Kamera-Gates (Select Gate Open) angepasst werden. Die Varianz über der Platte sollte idealerweise weniger als 7,5 % betragen.
- Wählen Sie "Aktualisieren", wenn Hintergrundwerte von 8.000-10.000 RLUs erhalten werden. Speichern Sie das Hauptprotokoll, indem Sie auf die Schaltfläche Speichern klicken.
Anmerkung: Auf diese Weise werden die Einstellungen aus dem Protokollsignaltest in das Hauptprotokoll übernommen.
- Führen Sie den Assay aus, indem Sie die Taste "RUN" drücken.
