>1. Messung der Zellernte und α-Galactosidase A oder Säure-α-Glucosidase-Aktivität
- Zellernte
- Am Tag der Ernte nehmen Sie die Zellen aus dem Inkubator und saugen das Medium an. Waschen Sie die Zellen vorsichtig 2 Mal mit PBS mit Ca2+ und Mg2+.
HINWEIS: Dieser Schritt ist kritisch, da DGJ und DNJ starke Inhibitoren von α-Galactosidase bzw. α-Glucosidase sind und Reste den Test ungültig machen würden.
- Geben Sie 200 μl entionisiertes Wasser direkt auf die Zellen. Spülen Sie die Zellen von der Platte ab und geben Sie sie in ein 1,5-ml-Reaktionsröhrchen.
>2. Homogenisierung durch Einfrieren und Auftauen
- Legen Sie die Proben in ein geeignetes Schaumstoffgestell und wirbeln Sie sie 5 s lang, um die Lyse effizienter zu gestalten. Die Proben wurden abwechselnd 10 s lang in flüssigem Stickstoff und bis zum Abschluss des Auftauens (5 min) in ein Wasserbad bei Raumtemperatur gelegt.
- Wiederholen Sie diesen Vorgang 5 Mal und drehen Sie die Proben dann 5 Minuten lang bei 10.000 x g. Bewahren Sie den Überstand auf und pipettieren Sie ihn in einem neuen Reaktionsröhrchen.
>3. Bestimmung der Proteinkonzentration mittels Bicinchoninsäure (BCA)-Assay
- Für jede Probe mit 40 μl deionisiertem H2O wird ein frisches Röhrchen vorbereitet und 10 μl der Probe zugegeben. Die Lösung wird durch kurzes Vortexen gemischt und 10 μl in einen Hohlraum einer 96-Well-Platte überführt (jede Probe in dreifacher Ausfertigung). Eine 2 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA)-Stammlösung in deionisiertem H2O wird wie folgt verdünnt, um eine Standardkurve zu erhalten: 50 μl H2O/50 μl BSA; 60 μL H2Ø/40 μL BSA; 70 μL H2O/30 μL BSA; 80 μL H2O/20 μL BSA; 90 μL H2O/10 μL BSA; 100 μL H2O.
- Beginnen Sie die Reaktion mit der Zugabe von 200 μl BCA-Reagenz (Reagenz A und Reagenz B werden im Verhältnis 50:1 gemischt) und inkubieren Sie 1 h im Dunkeln bei 37 °C unter leichtem Rühren auf einem Orbitalschüttler (300 U/min). Messen Sie die Extinktion bei 560 nm in einem Plattenleser.
Anmerkung: Die Proben enthalten typischerweise zwischen 1 und 1,5 μg Protein pro μL.
>4. Messung der Enzymaktivität mit künstlichen 4-Methylumbelliferyl-Substraten (4-MUG)
- Verdünnen Sie die berechnete Menge jeder Probe und pipettieren Sie sie in frische 1,5-ml-Reaktionsröhrchen, um 0,05 (für α-Galactosidase A) oder 0,5 (für saure α-Glucosidase) μg Protein/μl-Lösungen zu erhalten. Die Proben werden erneut 5 s lang vortexiert und 10 μl dieser Verdünnung in eine 96-Well-Platte pipettiert (jede Probe in doppelter Ausführung).
- Starten Sie die Reaktion durch Zugabe von 20 μl der jeweiligen Substratlösung:
Für α-Galactosidase A: 2 mM 4-Methylumbelliferyl-α-D-galactopyranosid (4-MU-gal) in 0,06 M Phosphatcitratpuffer, pH 4,7,
Für saure α-Glucosidase: 2 mM 4-Methylumbelliferyl α-D-Glucopyranosid (4-MU-glu) in 0,025 M Natriumacetat, pH 4,0.
- Die Enzymreaktionen werden 1 h im Dunkeln bei 37 °C unter leichtem Rühren auf einem Orbitalschüttler (300 U/min) inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von 200 μl 1,0 M und pH 10,5 angepasstem Glycin-NaOH-Puffer beendet.
- Bereiten Sie eine Standardkurve von 4-Methylumbelliferon (4-MU) aus einem Stamm von 0,01 mg/ml wie folgt vor:
100 μL H2O / kein 4-MU; 80 μL H2O / 20 μL 4-MU; 60 μL H2O/ 40 μL 4-MU; 40 μL H2O/ 60 μL 4-MU; 20 μL H2O/ 80 μL 4-MU; kein H2O/ 100 μL 4-MU, pipettieren Sie 10 μl jeder Verdünnung in die 96-Well-Platte (in Duplikaten) und fügen Sie 200 μl des 1,0 M Glycin-NaOH-Puffers in jede Vertiefung hinzu, um das Volumen und den pH-Wert einzustellen.
- Messen Sie die Enzymaktivität in einem Fluoreszenz-Reader, der mit dem entsprechenden Filterset ausgestattet ist, und analysieren Sie die Daten mit der entsprechenden Software für das Fluoreszenz-Reader-Gerät.
Anmerkung: Beide 4-MUG-Substrate werden unter Einwirkung von α-Galactosidase A oder saurer α-Glucosidase zu 4-MU reduziert. Bei freigesetztem 4-MU handelt es sich um ein Fluorochrom, das bei 360 nm bzw. 465 nm als Anregungs- bzw. Emissionswellenlänge mit einem Mikroplatten-Fluoreszenz-Reader gemessen werden kann.
