Beurteilung der Wirksamkeit einer antiviralen Testsubstanz durch einen Virusinaktivierungsassay

>1. Viraler Inaktivierungs-Assay

Hinweis: Beispiele für die Inkubationszeit und die Virusdosis für verschiedene Viren sind in Abbildung 1A aufgeführt. Höhere Konzentrationen des Virus können auch durch Erhöhung des MOI/PFU getestet werden.

1. Huh-7,5-Zellen werden in einer 96-Well-Platte (1 × 10,⁴ Zellen pro Well) gesät und bei 37 °C in einem 5 % CO₂ -Inkubator O/N inkubiert, um eine Monoschicht zu erhalten.
2. Inkubieren Sie die Testverbindungen oder Kontrollen (die Endkonzentrationen sind: CHLA = 50 μM; PUG = 50 μM; Heparin = 1.000 μg/ml; DMSO = 1%) mit den HCV-Partikeln bei 37 °C (Abbildung 1A, "Langzeit") im Verhältnis 1:1. Geben Sie beispielsweise zu einem 100-μl-Virusinokulum, das 1 x 104 FFU enthält, 100 μl einer 100 μM CHLA-Arbeitsverdünnung; Dies führt zu einer CHLA-Behandlung mit einer Endkonzentration von 50 μM.
3. Verdünnen Sie das Virus-Wirkstoff-Gemisch auf eine "subtherapeutische" (unwirksame) Konzentration der Testverbindungen. Zum Beispiel liegt die unwirksame Konzentration von CHLA und PUG gegen HCV bei 1 μM31; Dies erfordert daher eine 50-fache Verdünnung des Virus-Wirkstoff-Gemisches, die mit 9,8 ml Basalmedium (Zellkulturmedium mit 2% FBS) erreicht werden kann.
   Hinweis: Die Verdünnung auf subtherapeutische Konzentration verhindert eine signifikante Wechselwirkung zwischen den Testverbindungen und der Wirtszelloberfläche und ermöglicht die Untersuchung der Behandlungswirkung auf die zellfreien Virionen. Es ist zu beachten, dass diese Verdünnung von der antiviralen Dosiswirkung der Prüfsubstanzen gegen die jeweilige Virusinfektion abhängt und vor der Durchführung dieses speziellen Assays bestimmt wird.
4. Zum Vergleich ist das Virus mit den Testverbindungen zu mischen und sofort (ohne Inkubationszeit) auf eine subtherapeutische Konzentration vor der Infektion zu verdünnen (Abbildung 1A, "Kurzfristig").
5. Geben Sie 100 μl des verdünnten HCV-Wirkstoffgemisches auf die Huh-7,5-Zell-Monoschicht (die Virusmenge beträgt jetzt 1 x 10² FFU; endgültiges MOI = 0,01) und inkubieren Sie 3 Stunden bei 37 °C, um eine Virusadsorption zu ermöglichen.
6. Entfernen Sie nach der Infektion die verdünnte Inokula und waschen Sie die Vertiefungen zweimal vorsichtig mit 200 μl PBS.
   Anmerkung: Führen Sie die Wäschen vorsichtig durch, um ein Anheben der Zellen zu vermeiden.
7. 100 μl Basalmedium auf jede Vertiefung geben und 72 Stunden lang bei 37 °C inkubieren.
8. Analysieren Sie die resultierende Infektion, indem Sie den Überstand auf Luziferaseaktivität untersuchen.

Abbildung 1. Inaktivierung von Virusinfektionen durch die Testsubstanzen CHLA und PUG. Verschiedene Viren wurden mit den Testsubstanzen über einen langen Zeitraum (1,5 – 3 Stunden vor der Titration inkubiert; hellgraue Balken) oder einen kurzen Zeitraum (sofort verdünnt; dunkelgraue Streifen) bei 37 °C behandelt, bevor sie auf eine subtherapeutische Konzentration verdünnt und anschließend die Infektion an den jeweiligen Wirtszellen analysiert wurden. (A) Schematische Darstellung des Experiments (links dargestellt) mit der endgültigen Viruskonzentration (PFU/Well oder MOI), der langfristigen Inkubationszeit des Virus-Wirkstoffs (i) und der anschließenden Inkubationszeit (ii), die für jedes Virus in der Tabelle rechts angegeben sind. Analysen für (B) HCMV, (C) HCV, (D) DENV-2, (E) MV und (F) RSV sind in jedem zusätzlichen Panel angegeben. Die Ergebnisse wurden gegen die DMSO-Negativkontrollbehandlung für Virusinfektionen aufgetragen und die gezeigten Daten sind die Mittelwerte ± Standardfehlern des Mittelwerts (SEM) aus drei unabhängigen Experimenten. Diese Abbildung wurde gegenüber der Referenz geändert.