Beurteilung der Wirksamkeit einer antiviralen Testsubstanz durch einen Virusinaktivierungsassay

Zusammenfassung

Quelle: Tai, C. et al., Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of antiviral Compounds. J. Vis. Exp. (2015)

Dieses Video zeigt den viralen Inaktivierungsassay und zeigt die Bewertung der Wirkung von antiviralen Wirkstoffen auf virale Partikel

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Protokoll

>1. Viraler Inaktivierungs-Assay

Hinweis: Beispiele für die Inkubationszeit und die Virusdosis für verschiedene Viren sind in Abbildung 1A aufgeführt. Höhere Konzentrationen des Virus können auch durch Erhöhung des MOI/PFU getestet werden.

1. Huh-7,5-Zellen werden in einer 96-Well-Platte (1 × 10,⁴ Zellen pro Well) gesät und bei 37 °C in einem 5 % CO₂ -Inkubator O/N inkubiert, um eine Monoschicht zu erhalten.
2. Inkubieren Sie die Testverbindungen oder Kontrollen (die Endkonzentrationen sind: CHLA = 50 μM; PUG = 50 μM; Heparin = 1.000 μg/ml; DMSO = 1%) mit den HCV-Partikeln bei 37 °C (Abbildung 1A, "Langzeit") im Verhältnis 1:1. Geben Sie beispielsweise zu einem 100-μl-Virusinokulum, das 1 x 104 FFU enthält, 100 μl einer 100 μM CHLA-Arbeitsverdünnung; Dies führt zu einer CHLA-Behandlung mit einer Endkonzentration von 50 μM.
3. Verdünnen Sie das Virus-Wirkstoff-Gemisch auf eine "subtherapeutische" (unwirksame) Konzentration der Testverbindungen. Zum Beispiel liegt die unwirksame Konzentration von CHLA und PUG gegen HCV bei 1 μM31; Dies erfordert daher eine 50-fache Verdünnung des Virus-Wirkstoff-Gemisches, die mit 9,8 ml Basalmedium (Zellkulturmedium mit 2% FBS) erreicht werden kann.
   Hinweis: Die Verdünnung auf subtherapeutische Konzentration verhindert eine signifikante Wechselwirkung zwischen den Testverbindungen und der Wirtszelloberfläche und ermöglicht die Untersuchung der Behandlungswirkung auf die zellfreien Virionen. Es ist zu beachten, dass diese Verdünnung von der antiviralen Dosiswirkung der Prüfsubstanzen gegen die jeweilige Virusinfektion abhängt und vor der Durchführung dieses speziellen Assays bestimmt wird.
4. Zum Vergleich ist das Virus mit den Testverbindungen zu mischen und sofort (ohne Inkubationszeit) auf eine subtherapeutische Konzentration vor der Infektion zu verdünnen (Abbildung 1A, "Kurzfristig").
5. Geben Sie 100 μl des verdünnten HCV-Wirkstoffgemisches auf die Huh-7,5-Zell-Monoschicht (die Virusmenge beträgt jetzt 1 x 10² FFU; endgültiges MOI = 0,01) und inkubieren Sie 3 Stunden bei 37 °C, um eine Virusadsorption zu ermöglichen.
6. Entfernen Sie nach der Infektion die verdünnte Inokula und waschen Sie die Vertiefungen zweimal vorsichtig mit 200 μl PBS.
   Anmerkung: Führen Sie die Wäschen vorsichtig durch, um ein Anheben der Zellen zu vermeiden.
7. 100 μl Basalmedium auf jede Vertiefung geben und 72 Stunden lang bei 37 °C inkubieren.
8. Analysieren Sie die resultierende Infektion, indem Sie den Überstand auf Luziferaseaktivität untersuchen.

Ergebnisse

Abbildung 1. Inaktivierung von Virusinfektionen durch die Testsubstanzen CHLA und PUG. Verschiedene Viren wurden mit den Testsubstanzen über einen langen Zeitraum (1,5 – 3 Stunden vor der Titration inkubiert; hellgraue Balken) oder einen kurzen Zeitraum (sofort verdünnt; dunkelgraue Streifen) bei 37 °C behandelt, bevor sie auf eine subtherapeutische Konzentration verdünnt und anschließend die Infe...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
DMEM	GIBCO	Nr. 11995-040
FBS	GIBCO	Tel.: 26140-079
Penicillin-Streptomycin	GIBCO	Tel.: 15070-063
Amphotericin B	GIBCO	Artikel-Nr.: 15290-018
Dmso	Sigma	Nr. D5879
In-vitro-Toxikologie-Assay-Kit, XTT-basiert	Sigma	TOX2
PBS pH 7,4	GIBCO	10010023
Mikroplatten-Reader	Thermo Scientific	Tel.: 89087-320
Mikrozentrifuge	Thermo Scientific	75002420
BioLux Gaussia-Luziferase-Assay-Kit	Neuengland Biolabore	E3300L
Luminometer	Promega	GloMax-20/20
Natriumcitrat, Dihydrat	Sigma	Artikel-Nr.: 71402
Kaliumchlorid	Sigma	Nr. P5405