Hinweis: Stellen Sie sicher, dass alle Verfahren, die Zellkultur- und Virusinfektionen beinhalten, in zertifizierten Biosicherheitshauben durchgeführt werden, die für das Biosicherheitsniveau der zu handhabenden Proben geeignet sind. Zur Beschreibung der Protokolle wird Gaussia luciferase reporter-tagged HCV als Modellvirus verwendet. Im Rahmen der repräsentativen Ergebnisse werden die Verbindungen Chebulaginsäure (CHLA) und Punicalagin (PUG) als antivirale Kandidaten eingesetzt, die auf die Wechselwirkungen von viralen Glykoproteinen mit Glykosaminoglykanen auf der Zelloberfläche während der frühen viralen Eintrittsschritte abzielen. Heparin, von dem bekannt ist, dass es den Eintritt vieler Viren stört, wird in einem solchen Zusammenhang als Positivkontrollbehandlung eingesetzt.
>1. Zellkultur, Herstellung von Verbindungen und Zytotoxizität von Verbindungen
- Züchten Sie die jeweilige Zelllinie für das zu analysierende Virusinfektionssystem (Tabelle 1). Bei HCV züchten Sie die Huh-7,5-Zellen in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), 200 U/ml Penicillin G, 200 μg/ml Streptomycin und 0,5 μg/ml Amphotericin B.
- Bereiten Sie die Testverbindungen und Kontrollen mit den entsprechenden Lösungsmitteln vor: lösen Sie z. B. CHLA und PUG in Dimethylsulfoxid (DMSO) auf, bereiten Sie Heparin in sterilem doppelt destilliertem Wasser vor. Für alle nachfolgenden Verdünnungen ist Nährmedium zu verwenden.
Hinweis: Die Endkonzentration von DMSO in den Testpräparaten beträgt in den Versuchen weniger als 1 %; 1 % DMSO ist als Negativkontrollbehandlung in den Assays zum Vergleich enthalten.
- Bestimmen Sie die Zytotoxizität der Testverbindungen (z. B. CHLA und PUG) auf den Zellen für die Virusinfektion unter Verwendung eines Reagenzes zur Bestimmung der Zellviabilität wie XTT (2,3-bis[2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl]-5-phenylamino)-carbonyl]-2H-tetrazoliumhydroxid):
- Für HCV werden Huh-7,5-Zellen in einer 96-Well-Platte (1 × 104 Zellen pro Well) ausgesät und bei 37 °C in einem 5 % CO2 -Inkubator O/N inkubiert, um eine Monoschicht zu erhalten.
- Die DMSO-Kontrolle (1 %) oder steigende Konzentrationen der Testverbindungen CHLA und PUG (z. B. 0, 10, 50, 100 und 500 μM) sind in dreifacher Ausfertigung auf die Kulturvertiefungen aufzutragen.
- Inkubieren Sie 72 Stunden lang bei 37 °C, verwerfen Sie dann das Medium in der Platte und waschen Sie die Zellen zweimal mit 200 μl phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
- Geben Sie 100 μl Testlösung aus dem XTT-basierten In-vitro-Toxikologie-Assay-Kit in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platten weitere 3 Stunden bei 37 °C, um die XTT-Formazan-Produktion zu ermöglichen.
- Bestimmen Sie die Absorption mit einem Mikroplatten-Reader bei einer Testwellenlänge von 492 nm und einer Referenzwellenlänge von 690 nm.
- Berechnen Sie den Prozentsatz der überlebenden Zellen anhand der folgenden Formel: Zellviabilität (%) = At / As × 100 %, wobei sich "At" und "As" auf die Absorption der Testverbindungen bzw. die Lösungsmittelkontrollbehandlungen (z. B. 1 % DMSO) beziehen. Bestimmen Sie die Konzentration von 50 % zellulärer Zytotoxizität (CC50) der Testverbindungen mit einer Analysesoftware wie GraphPad Prism gemäß dem Protokoll des Herstellers.
>2. Auslesen der Virusinfektion
Hinweis: Die Auslesung einer Virusinfektion hängt vom verwendeten Virussystem ab und kann Methoden wie Plaque-Assays oder das Messen von Reportersignalen von Reporter-getaggten Viren beinhalten. Im Folgenden wird das Verfahren zum Nachweis einer Reporter-HCV-Infektion anhand der Luciferase-Reporteraktivität beschrieben.
- Die Überstände aus den infizierten Vertiefungen auffangen und bei 17.000 x g in einer Mikrozentrifuge für 5 min bei 4 °C klären.
- Mischen Sie 20 μl Testüberstand mit 50 μl Luciferase-Substrat aus dem Gaussia-Luciferase-Assay-Kit und messen Sie direkt mit einem Luminometer gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Exprimieren Sie die HCV-Infektiosität als log10 der relativen Lichteinheiten (RLU) zur Bestimmung der Virushemmung (%) und berechnen Sie die effektive Konzentration (EC50) der Testverbindungen gegen HCV-Infektionen unter Verwendung von Algorithmen aus der GraphPad Prism Software gemäß dem Protokoll des Herstellers.
>3. Viruseintritts-/Fusionsassay
Hinweis: Beispiele für Inkubationszeiten und Virusdosen für verschiedene Viren sind in Abbildung 1A 'Entry/Fusion' aufgeführt. Höhere Konzentrationen des Virus können auch durch Erhöhung des MOI/PFU getestet werden.
- Huh-7,5-Zellen werden in einer 96-Well-Platte (1 × 104 Zellen pro Well) gesät und bei 37 °C in einem 5 % CO2 -Inkubator O/N inkubiert, um eine Monoschicht zu erhalten.
- Die Zellmonoschichten in Platten bei 4 °C 1 Stunde vorkühlen.
- Infizieren Sie die Zellen mit HCV (Multiplicity of Infection, MOI = 0,01) bei 4 °C für 3 Std. Verwenden Sie z. B. ein 100 μl Virus-Inokulum, das 1 x 102 Focus Forming Units (FFU) enthält.
Anmerkung: Führen Sie die Zugabe des viralen Inokulums auf Eis und die anschließende Inkubation in einem 4 °C Kühlschrank durch, um die Temperatur auf 4 °C zu halten, was eine Virusbindung, aber keinen Eintritt ermöglicht.
- Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie die Zellmonolagen vorsichtig zweimal vorsichtig mit 200 μl eiskaltem PBS.
Anmerkung: Führen Sie die Wäschen vorsichtig durch, um ein Anheben der Zellen zu vermeiden.
- Behandeln Sie die Vertiefungen mit den Testverbindungen oder Kontrollen (die Endkonzentrationen sind: CHLA = 50 μM; PUG = 50 μM; Heparin = 1.000 μg/ml; DMSO = 1%) und 3 Stunden bei 37 °C inkubieren. Geben Sie z. B. 10 μl einer 500 μM CHLA-Arbeitsverdünnung zu 90 μl Medium, mischen und behandeln Sie die Wells. Dies führt zu einer CHLA-Behandlung mit einer Endkonzentration von 50 μM.
Anmerkung: Die Verschiebung von 4 °C auf 37 °C erleichtert nun das virale Eintritts-/Fusionsereignis und ermöglicht somit eine Bewertung der Wirkung der Testsubstanzen auf diesen speziellen Schritt.
- Aspirieren Sie den arzneimittelhaltigen Überstand und entfernen Sie nicht internalisierte extrazelluläre Viren, indem Sie ihn entweder mit 200 μl Citratpuffer (50 mM Natriumcitrat, 4 mM Kaliumchlorid, pH 3,0) oder PBS waschen. 100 μl des Basalmediums werden vor der Inkubation bei 37 °C für 72 Stunden aufgetragen
.
- Analysieren Sie die resultierende Infektion, indem Sie den Überstand auf Luciferase-Aktivität untersuchen, wie in '2 beschrieben. Auslesen der Virusinfektion".
