Kolorimetrischer Nachweis eines bakteriellen Biomarkers mittels eines modifizierten Lackmustests

Zusammenfassung

Quelle: Tram, K., et al. Kolorimetrischer Nachweis von Bakterien mit Lackmustest. J. Vis. Exp. (2016).

Dieses Video demonstriert eine kolorimetrische E. coli-Nachweismethode, bei der ein E. coli-Biomarker ein DNAzym aktiviert, was zur Spaltung der RNA-Bindung und zur Ablösung eines DNAzym-Urease-Konjugats führt. Ein anschließender kolorimetrischer Assay weist den E. coli-Biomarker durch ammoniakinduzierte pH-Änderungen nach.

Protokoll

>1. Vorbereitung von E. coli-Zellen für den Test

1. Für eine gewünschte Zellsuspension geben Sie 1 ml kultivierten Stamm in ein 1,5-ml-Mikrofuge-Röhrchen.
2. Die Zellen bei 6.000 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugieren. Den Überstand vorsichtig entfernen, ohne das Küvettenpellet zu stören.
3. Geben Sie 10 μl Reaktionspuffer zum Zellpellet und resuspendieren Sie die Zellen. Beschallen Sie die Zellsuspension für 5 Minuten. Übertragen Sie die Zellsuspension für 5 Minuten in eine Eisbox.
4. Beschallen Sie die Zellsuspension für weitere 5 Minuten.
5. Die Zellsuspension wird bei 13.000 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert. Zur Prüfung ist der Überstand (10 μl) zu verwenden.

>2. Lackmustest

1. In einem 1,5-ml-Mikrofugenröhrchen wird das Röhrchen vorgewaschen, indem 100 μl Reaktionspuffer (RB) in das Mikrofugeröhrchen gegeben und vortexiert und der Puffer verworfen wird.
2. Übertragen Sie 15 μl des zusammengesetzten EC1 in das gewaschene Mikrofugenröhrchen.
3. Waschen Sie die Magnetkügelchen, indem Sie das Mikrofuge-Röhrchen auf ein Magnetgestell legen. Entfernen Sie den Überstand durch Pipettieren. Nehmen Sie das Mikrofuge-Röhrchen aus dem Rack, fügen Sie 100 μl RB hinzu und resuspendieren Sie die Magnetkügelchen vorsichtig.
4. Waschen Sie das MB noch zweimal, indem Sie Schritt 2.3 wiederholen.
5. Setzen Sie das Mikrofugenröhrchen wieder auf das Magnetgestell, entfernen Sie den Überstand und fügen Sie die in Schritt 1.3 vorbereitete 10-μl-E. coli-Probe hinzu.
6. Mischen Sie die Probe und die Magnetkügelchen vorsichtig, indem Sie vorsichtig auf das Mikrofugenröhrchen klopfen.
7. Inkubieren Sie die Reaktion 1 Stunde lang bei Raumtemperatur.
8. Zur Reaktion werden 90 μl ddH₂O zugegeben und das Mikrofugenröhrchen auf ein Magnetgestell gestellt.
9. Nach ca. 3 min magnetischer Trennung werden vorsichtig 85 μl des Überstands in ein 0,5-ml-Mikrofuge-Röhrchen überführt. Ziehen Sie den Überstand langsam heraus, um zu vermeiden, dass sich magnetische Kügelchen ansammeln.
10. In das obige Mikrofugenröhrchen werden 15 μl 0,04 % Phenolrot und 100 μl Substratlösung gegeben.
11. Nehmen Sie ein Foto in bestimmten Zeitintervallen auf, um Farbänderungen aufzuzeichnen.
    Anmerkung: Die Änderung des pH-Werts kann auch mit einem pH-Messgerät mit Mikroelektrode überwacht werden. Der Ausgangs-pH-Wert sollte etwa 5,2-5,5 betragen (die Lösung ist gelb). Ist dies nicht der Fall, kann die Lösung durch Zugabe von 1 mM Acetatpuffer (pH 5,0) angepasst werden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)	VWR AMRESCO	Nr. 105
Natriumhydroxid (NaOH) Pellets	BIO BASIC KANADA INC	Nr. SB6789
Tris-Basis	VWR AMRESCO	497
Harnstoff	VWR AMRESCO	M123
Xylolcyanol FF	SIGMA-ALDRICH	Nr. X-4126
0,04% Phenolrot	SIGMA-ALDRICH	Nr. P3532
10x T4 Polynukleotidkinase Reaktionspuffer	Luzien	30061-1
E. coli K12 (MG1655)	ATCC	ATCC700926
Magnetische Perle (BioMag)	Bangs Laboratories Inc
Magnetisches Trenngestell	New England BioLabs	Nr. S1506S
Mikrofuge-Röhrchen	Sarstedt	72,69
Inkubator für Zellkulturen	Eppendorf Scientific	M13520000
Branson Ultraschallreiniger	Branson	N/A