Ein Luciferase-Reporter-Assay zur Untersuchung der Translationsregulation in Pockenvirus-infizierten Zellen

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Quelle: Dhungel, P., et al. In-vitro transkribierter RNA-basierter Luciferase-Reporter-Assay zur Untersuchung der Translationsregulation in Pockenvirus-infizierten Zellen. J. Vis. Exp. (2019)

Dieses Video zeigt einen Assay zur Untersuchung der Translationsregulation in Pockenvirus-infizierten Zellen. Nicht infizierte und virusinfizierte Zellen wurden mit mRNAs co-transfiziert, die für Glühwürmchen-Luziferase (Fluc) und Renilla-Luziferase (Rluc) ko-transfizieren, wobei die Fluc-mRNA eine 5'-Poly(A)-Leader-Sequenz enthielt. Nach dem Hinzufügen von biolumineszierenden Substraten zu lysierten Zellen messen Sie das Signal von beiden Luciferasen, um den translationalen Vorteil der Fluc mRNA in virusinfizierten Zellen zu identifizieren, der durch die Leader-Sequenz verliehen wird.

Protokoll

>1. mRNA in Zellen transfizieren

HeLa-Zellen in einer 24-Well-Platte säen (um am nächsten Tag ca. ~80-90% konfluent zu sein) und über Nacht in einem Inkubator bei 37 °C mit 5% CO₂ inkubieren.
Infizieren Sie HeLa-Zellen mit dem Vaccinia-Virus (VACV) bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 5 oder bewahren Sie nicht infizierte HeLa-Zellen zum Vergleich auf.
Anmerkung: MOI ist die Anzahl der infektiösen Viruspartikel pro Zelle.
MOI von X = {[(Anzahl der Zellen * X) / Virustiter] * 1000} μl Virus pro 1 ml Medium.
Nach der gewünschten h Postinfektion (hpi) (in diesem Experiment bei 10-12 hpi) transfiktierte mRNA (500 ng Gesamt-mRNA pro Well von 24-Well-Platten) unter Verwendung eines kationischen Lipidtransfektionsreagenzes, wie in Abbildung 1C gezeigt.
1. Mischen Sie für eine Vertiefung einer 24-Well-Platte 480 ng 12A-Sequenz mit Glühwürmchen-Luziferase (12A-Fluc)-mRNA und 20 ng Kozak-Sequenz mit Renilla-Luziferase (Kozak-Rluc)-mRNA in einem Mikrozentrifugenröhrchen. In ein anderes Mikrozentrifugenröhrchen geben Sie 1,1 μl kationisches Lipidtransfektionsreagenz.
2. Geben Sie 55 μl reduziertes Serummedium in beide Röhrchen. Mischen und bei Raumtemperatur 5 min inkubieren.
3. Nach 5 Minuten Inkubation 55 μl kationisches Lipidtransfektionsreagenz mit reduziertem Serummedium in ein mRNA-mRNA-haltiges Röhrchen geben.
4. Vorsichtig, aber gründlich mischen und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
5. Entfernen Sie während der Inkubation das Zellkulturmedium und fügen Sie 400 μl reduziertes Serummedium pro Vertiefung von 24-Well-Platten hinzu.
6. Nach der Inkubation 100 μl der Mischung tropfenweise und gleichmäßig in eine Vertiefung mit 24-Well-Platten geben.

>2. Luziferase-Aktivitäten messen

Fünf Stunden nach der Co-Transfektion von 12A-Fluc und Kozak-Rluc mRNA messen Sie die Luciferase-Aktivität mit einem Luciferase-Assay-System, das in der Lage ist, zwei Reporter-Assays durchzuführen (z. B. Dual-Luciferase Reporter Assay Kit).
Entfernen Sie das reduzierte Serummedium und lysieren Sie die Zellen durch Zugabe von 150 μl 1x Lysepuffer, einer Komponente des Luciferase-Assay-Kits.
Nach einer 10-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur wird das Lysat durch Verschrotten der Zellen aufgefangen und in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführt.
Zentrifugieren Sie das Lysat bei 12.000 x g für 10 min bei 4 °C, um Zellreste zu pelletieren.
Geben Sie 30 μl Überstand in eine undurchsichtige weiße 96-Well-Testplatte mit festem Boden.
Messen Sie die duale Lumineszenz mit dem Luciferase-Assay-Kit und einem Multimode-Plattenleser-Luminometer.
Führen Sie die Messung mit der Kinetikfunktion (pro Well) unter Verwendung der in Tabelle 1.
beschriebenen Einstellungen durch. Anmerkung: Die Messung kann auch mit einem manuellen Luminometer erfolgen. Geben Sie das gleiche Volumen an Lysat und Substrat für Fluc in eine Küvette. Warten Sie 2 s und messen Sie 10 s lang mit einem Luminometer. Nehmen Sie nach der Fluc-Messung schnell die Küvette aus dem Luminometer und fügen Sie manuell ein gleiches Volumen des Substrats für Rluc hinzu. Warten Sie erneut 2 s und messen Sie 10 Sekunden lang mit einem Luminometer.
Exportieren Sie die Lumineszenzmessdaten in ein gewünschtes Dateiformat.
Bestimmen Sie die relative Translationsrate von 12A-Fluc mRNA in nicht infizierten und VACV-infizierten HeLa-Zellen, indem Sie den Fluc-Wert durch den Rluc-Wert der internen Kontrolle dividieren.
HINWEIS: Abbildung 2 zeigt die Schritt-für-Schritt-Analyse von Rohdaten, um die relative Fluc-Aktivität zu erhalten.

Tabelle 1: Einstellungen für die Luziferase-Messung – die Schritte für die Luziferase-Messung mit dem empfohlenen Volumen oder der empfohlenen Zeit.

Schritte	Volumen/Zeit
Injizieren Sie das Luciferase-Assay-Substrat (Fluc):	30 μL
Wartezeit / Inkubationszeit:	2 Sek.
Lumineszenzmessung (Fluc):	10 Sek.
Stop & Glo Substrat (Rluc):	30 μL
Wartezeit / Inkubationszeit:	2 Sek.
Lumineszenzmessung (Rluc):	10 Sek.

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Ergebnisse

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Abbildung 1: mRNA-Synthese und Transfektion. (A) Schematische Darstellung der In-vitro-Transkription. Als Template wird durch PCR amplifizierte DNA, die das Luciferase-Gen stromabwärts der interessierenden 5'-UTR und den T7-Promotor enthält, verwendet. Die T7-RNA-Polymerase wird an den Promotor rekrutiert und fügt Ribonukleotide, die in Weiß dargestellt sind, in 5'- bis 3...